一种叶艺兰组培生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及涉及叶艺兰花品种的组织培养繁殖方法。
【背景技术】
[0002]叶艺兰是兰花的一个重要观赏种类，在兰花的选育、驯化、栽培中出现了一类以赏叶为主的兰花品种，这些品种的叶片出现了金边、金心、银边、银心、缟艺、斑艺等叶艺，具有极高的观赏价值。这些叶色的变异多数是由于部分细胞变异引起叶色的变化，形成嵌合体植株，这种性状是不能通过种子繁殖保持的，只能通过无性繁殖保存，其性状多不稳定，但部分叶艺性状如银边、银拖等在分株繁殖时是比较稳定的；植物组织培养其实质也是无性繁殖，但在叶艺兰组织培养时，叶艺性状丢失频率较高，失艺植株的观赏性下降，直接影响到商品的价格。如果在叶艺兰组培苗生产时减少失艺频率，可以大大提高生产效率。目前有少量这方面的研究报道，但在生产实践中仍存在较大的问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对大花蕙兰叶艺品种在组培过程中出现失艺的问题，通过调整培养基配方，结合培养物前期形态选择，提供一种叶艺兰组培生产方法，以降低叶艺品种组培失艺的频率。
[0004]本发明的叶艺兰组培生产方法，其特征包括以下步骤:
步骤1、材料选择:叶艺兰组培增殖的PLB (类原球茎)；
步骤2、PLB(类原球茎)增殖:与常规PLB增殖方式中对PLB进行水平和垂直切割不同，本发明自基部将完整的PLB切下后，整个接种到增殖培养基上，通过完整的PLB表面分化出新PLB进行增殖，继代操作中，只选择鲜绿色的PLB进行增殖，将颜色深绿和白化的PLB丢弃。本发明不采用通常所用的将PLB进行多次切割形成小块的增殖方法，以保持其嵌合状态，降低叶艺丢失的频率。本发明所采用的增殖培养基上，所接材料的PLB在嵌合状态、白化状态和正常状态下颜色差异明显，可通过颜色将大部分失艺材料筛选出来，在继代过程中将颜色深绿和白化的PLB丢弃，保证增殖材料处于嵌合状态。
[0005]步骤3、PLB分化:将经过筛选增殖的PLB转接到液体分化培养基上，震荡培养14?21天后PLB上端分化出苗。本发明所采用的分化培养基上分化出的苗85%以上保持了叶艺性状。
[0006]步骤4、生根壮苗培养:将分化培养基上形成的Icm左右高的带艺小苗转接到生根培养基上，培养7天左右可见小苗下端生根，继续培养30?50天可形成健壮植株。
[0007]步骤5、试管苗移栽:当植株约3?5cm高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗7?10天，然后将其从培养容器中取出，洗净根部的培养基，移入经发酵的松树皮培养基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95%以上。
[0008]其中，步骤2的培养条件为培养温度22?24°C，光照度1500?20001x，光照12小时/天。步骤3中的培养条件为培养温度25?28°C，光照度1500?20001x，光照12小时/天，摇床转速lOOrpm。步骤4中的培养条件为培养温度25?28°C，光照度1500?20001x，光照12小时/天。
[0009]进一步的，步骤2中增殖培养基采用大量和微量元素减半的MS培养基(1/2MS)为基本培养基，附加蛋白胨(P印tone) 0.5?3g.L \水解酪蛋白(CH)0.2?0.5g.L \萘乙酸(NAA) 0.1 ?I mg.L \多效挫(PP333) 0.1 ?0.5mg.L \香焦勾楽 50 ?200 g.L \鹿糖15?308丄1，琼脂6?78丄1，活性炭(八0 0.5?2 g.L SpH 5.4?5.6。
[0010]步骤3中分化培养基采用1/2MS培养基为基本培养基，附加蛋白胨0.5?3g.L \水解酪蛋白0.2?0.5g.L \噻重氮苯基脲(TDZ) 0.1?0.5 mg.L \椰子乳(CM) 50?200ml.L \ 鹿糖 15 ?30g.L SpH 5.4 ?5.6。
[0011]步骤4中生根壮苗培养基为花宝I号(Hyponex I) 1.5?3g.L1、蛋白胨0.5?3g g.L\水解酪蛋白0.2?0.5g.L\萘乙酸0.5?2 mg.L\香蕉勾楽50?200 g.L \蔗糖15?30 g.L\琼脂6?7 g.L1、活性炭0.5?2 g.L\其余为MS培养基中的维生素和肌醇成分；pH 5.4?5.6。
[0012]步骤2中，及时继代的PLB (类原球茎)在分化培养基上多保持鲜绿色，少数失艺的材表现为浅黄色(白化症状)或深绿色。在增殖培养继代过程中，结合PLB颜色，将明显白化的和深绿色的外植体切除，只保留鲜绿色PLB，可大大提高叶艺种苗频率。深绿色PLB可用于无艺植株的培育，也具有商品性。
[0013]本发明适用于叶色相关基因变异引起的嵌合体材料，如国兰中的金边艺、金爪艺、银边艺、心艺等。本发明所发明的培养基一方面可保证叶艺兰PLB的正常增殖，另一方面，在所提供的光照、温度条件下，可以使供试品种的PLB在带艺与不带艺之间，出现明显的色差，以利于前期通过形态观察去除失艺外植体，从而提高生产效率。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0015]实施例1:组培品种:爪艺金边小神童方法与步骤:
步骤1:增殖培养
1.1、选取爪艺明显的金边小神童无菌苗，切去叶片和根，接种于增殖培养基(1/2MS+P印tone I g.L ^CH 0.5 g.L J+NAA1 mg.L \ΡΡ333 0.2 mg.L 香蕉匀浆 100g.L 鹿糖 30g.L 琼脂 6g.L 活性炭 lg.L SpH 5.4)上。
[0016]1.2、4-6周后材料边缘出现草绿色PLB，将PLB沿基部切下转接到新的增殖培养基上。
[0017]1.3、4-6周后PLB增殖形成有5_8个PLB的团状，将PLB沿基部切下，转接到新的培养基上增殖。
[0018]1.4、不断重复步骤1.3，其间，如果所形成的PLB为深绿色或白化(黄色或白色)，则在继代过程中丢弃不要。继代次数不宜超过15代。
[0019]步骤2:分化和生根培养
2.1、将 PLB 接种到液体分化培养基(1/2MS+P印tone 0.5g.L ^CH 0.5g.L ^TDZ 0.5mg.L '+CM 100 ml.L '+蔗糖 15g.L SpH 5.4)上，25 — 28°C，光照度 1500 ?20001x，光照12小时/天，10rpm培养14-21周，可见PLB形成小芽。
[0020]2.2、将小芽接种到壮苗培养基(Hyponex I 2g.L ^Peptone I g.L ^CH 0.5 g.L:+NAA lmg.L:+ 香蕉勾楽 100 g.L:+ 鹿糖 20g.L:+ 琼脂 6g.L:+ 活性炭 lg.L SpH 5.4)上，培养7天后可见新根长出，芽长高。
[0021]2.3、继续培养30-50天，形成可移栽叶艺成品苗。
[0022]采用本发明，所生产种苗90%以上为带爪艺的叶艺苗，另有少量不带艺的全绿苗，几乎没有白化苗，因为PLB筛选时已将白化PLB筛选掉。
[0023]当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种叶艺兰组培生产方法，其特征在于包括如下步骤: 步骤1、材料选择:选择叶艺兰组培增殖的PLB作为培养材料； 步骤2、PLB增殖:自基部将完整的PLB切下后，整个接种到增殖培养基上，通过完整的PLB表面分化出新PLB进行增殖； 步骤3、PLB分化:将经过筛选增殖的PLB转接到液体分化培养基上，震荡培养14?21天后PLB上端分化出苗； 步骤4、生根壮苗培养:将分化培养基上形成的Icm左右高的带艺小苗转接到生根培养基上，培养5?10天至小苗下端生根，继续培养30?50天至形成健壮植株； 步骤5、试管苗移栽:当植株3?5cm高时，，将培养瓶转移到自然光下炼苗7?10天，然后将其从培养容器中取出，洗净根部的培养基，移入经发酵的松树皮培养基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95%以上。2.根据权利要求1所述的叶艺兰组培生产方法，其特征在于:步骤2中的培养条件为培养温度22?24°C，光照度1500?20001x，光照12小时/天；步骤3中的培养条件为培养温度25?28°C，光照度1500?20001x，光照12小时/天，摇床转速10rpm ;步骤4中的培养条件为培养温度25?28°C，光照度1500?20001x，光照12小时/天。3.根据权利要求1所述的叶艺兰组培生产方法，其特征在于:自PLB基部切割获得完整的PLB作为外植体，通过完整的PLB表面分化出新PLB进行增殖。4.根据权利要求1所述的叶艺兰组培生产方法，其特征在于:步骤2中增殖培养基采用1/2MS培养基为基本培养基，附加蛋白胨0.5?3g.L \水解酪蛋白0.2?0.5g.L \萘乙酸0.1?I mg.L\多效挫0.1?0.5mg.L\香蕉勾楽50?200 g.L\鹿糖15?30g.L \琼脂6?7g.L \活性炭0.5?2 g.L SpH 5.4?5.6。5.根据权利要求1所述的叶艺兰组培生产方法，其特征在于:步骤3采用液体培养法，分化培养基采用1/2MS培养基为基本培养基，附加蛋白胨0.5?3g.L \水解酪蛋白0.2?0.5g.L \噻重氮苯基脲0.1?0.5 mg.L \椰子乳50?200 ml.L \鹿糖15?30g.L SpH5.4 ~ 5.6o6.根据权利要求1所述的叶艺兰组培生产方法，其特征在于:步骤4中生根壮苗培养基的成分包括:花宝I号1.5?3g.L1、蛋白胨0.5?3g g.L\水解酪蛋白0.2?0.5g.L\萘乙酸0.5?2 mg.L\香蕉勾楽50?200 g.L\鹿糖15?30 g.L\琼脂6?7g.L \活性炭0.5?2 g.L \其余为MS培养基中的维生素和肌醇成分；pH 5.4?5.6。7.根据权利要求1所述的叶艺兰组培生产方法，其特征在于:在增殖培养继代过程中，结合PLB颜色进行筛选，将明显白化的和深绿色的外植体去除，只保留鲜绿色PLB。
【专利摘要】本发明公开了一种叶艺兰组培生产方法，其包括如下步骤：选择叶艺兰组培增殖的PLB作为培养材料；自基部将完整的PLB切下后，整个接种到增殖培养基上，通过完整的PLB表面分化出新PLB进行增殖；将经过筛选增殖的PLB转接到液体分化培养基上，震荡培养14～21天后PLB上端分化出苗；将分化培养基上形成的1cm左右高的带艺小苗转接到生根培养基上，培养5～10天至小苗下端生根，继续培养30～50天至形成健壮植株；当植株3～5cm高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗7～10天，然后将其从培养容器中取出，洗净根部的培养基，移入经发酵的松树皮培养基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95%以上。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165631
【申请号】
【发明人】陈之林, 杨澜, 王爱华, 许红娟, 李英, 张朝君
【申请人】贵州省园艺研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月29日