一种野生山桃稠李组织培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养方法，具体为一种野生山桃稠李组织培养方法。
【背景技术】
[0002] 山桃稠李正名为斑叶稠李（学名：Padusmaackii(Rupr. )Kom)小乔木，高4-10m。 叶椭圆形，菱状卵形、稀有矩圆状倒卵形，长4-8cm，叶缘具不规则带腺锐锯齿，背面沿中脉 被短柔毛，被紫褐色腺体。总状花序，基部无叶。花白色，多花密集；花柱和雄蕊近等长。果 近球形，径5-7mm，紫褐色。花期4-5月，果期6-10月。润肥沃的砂质壤土上生长良好，萌 蘖力强，病虫害少。喜光也耐阴，抗寒力较强，怕积水涝洼，不耐干旱瘠薄，在湿润肥沃的砂 质壤土上生长良好，萌蘖力强，病虫害少。随着对园林绿化树种种类以及质量的需求与日倶 增，山桃稠李的发展前景十分广阔。
[0003]黑龙江省林业科学研究所在2009年-2014年在黑龙江省内的林区进行了大量的 调查，发现黑龙江省林区野生的山桃稠李具有良好的抗逆性，并且树干笔直，枝叶茂盛，花 期果期都很长，是优良的园林绿化树种。
[0004]2009年在黑龙江省哈尔滨市区，黑龙江省林业科学研究所苗圃进行了扦插繁殖， 成活率非常低。所以，又进行了种子繁殖实验，成活率相对高些，但是，出苗率仍然很低，苗 木成本非常高。而且，有性繁殖很难保存原生母本的优良特性。国内目前，针对黑龙江省林 区的野生山桃稠李的组织培养还没有系统的研究。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明的目的在于设计提供一种野生山桃稠李的组织培养方法的 技术方案，该方法采用不定芽增殖途径，经过不定芽增殖、壮苗、生根过程，直接建立试管苗 再生体系，该方法操作简单，繁殖系数高，有效保存了野生山桃稠李的特异种质资源的母本 遗传信息，为选育山桃稠李的新品系奠定基础。
[0006]本发明的一种野生山桃稠李组织培养方法，它是按照以下步骤进行的：
[0007]-、外植体的选取：外植体选取野外山桃稠李植株；
[0008]二、外植体消毒：取带顶芽的侧芽作为外植体剪成4~5cm的带芽茎段，采用洗衣 粉清洗干净，然后再用清水冲洗1~2h;置于超净工作台上用体积百分含量为75%的乙醇 浸泡30s，用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上风干，再用质量百分含量为0. 1 %升汞消毒 8min，然后用无菌水冲洗3次；
[0009]三、初代培养：将消毒外植体剪成1cm左右的茎段接入初代培养基中培养，培养条 件为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光照时间每天12h，培养30天；所述初代 培养基由改良WPS培养基+浓度为1.Omg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0. 5mg/L的萘乙 酸组成；
[0010] 四、不定芽的增殖培养：将初代培养的带芽茎段接入增殖培养基中培养，培养条件 为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光照时间每天12h，培养周期为40天；所述 增殖培养基由改良WPS+浓度为1. 5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0. 5mg/L的萘乙酸组 成；
[0011] 五、壮苗培养：将在增殖培养基中培养至长度达到1cm以上的不定芽逐个切下，接 入1/2改良WPS培养基中培养，培养条件为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光 照时间每天12h，培养周期为40天；
[0012] 六、生根培养：将壮苗培养基中的健康健壮的芽接入生根培养基中培养，培养条件 为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光照时间每天12h，培养30天；所述的生根 培养基由1/4改良WPS培养基+浓度为0. 5mg/L的萘乙酸组成；
[0013] 所述的改良WPS培养基由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：
[0014] 所述的大量元素为：（1)浓度为400mg/L的硝酸铵、（2)浓度为190mg/L的硝酸钾、 ⑶浓度为170mg/L的磷酸二氢钾、⑷浓度为370mg/L的硫酸镁、（5)浓度为684mg/L的 硝酸钙；
[0015] 所述的微量元素为：（1)浓度为27. 85mg/L的硫酸亚铁、（2)浓度为37. 28mg/L的 乙二胺四乙酸盐；
[0016] 所述的铁盐为：（1)浓度为22. 5mg/L的硫酸锰、（2)浓度为8. 6mg/L的硫酸锌、（3) 浓度为〇. 25mg/L的硫酸铜、（4)浓度为6. 2mg/L的硼酸、（5)浓度为0. 25mg/L的钼酸钠；
[0017] 所述的有机成分为：（1)浓度为0.lmg/L的盐酸硫胺素、（2)浓度为0. 5mg/L的盐 酸吡哆辛、⑶浓度为〇. 5mg/L的烟酸、⑷浓度为2.Omg/L的甘氨酸、（5)浓度为100mg/L 的肌醇。
[0018] 本发明包含以下有益效果：
[0019]采用本发明的方法带顶芽的侧芽萌发率高达82. 8 %，无菌萌发率达到61. 3 %，增 殖系数达到4. 89,生根率91. 2%。
[0020] 本发明的方法能较好的保持母本的抗逆性和观赏性，大大缩短了育苗周期，5个月 即可获得生根苗木，有效提高了山桃稠李的繁殖系数；与种子繁殖相比，组织培养可以有效 的提供低成本的高观赏性的绿化苗木，能有效降低苗木成本，节省开支；与体胚发生组织培 养方法相比，采用不定芽增殖并直接生根成苗的方法，大大降低了母本发生变异的风险，能 更好的保持母本的抗逆性和观赏性。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0021] 一：本实施方式的一种野生山桃稠李组织培养方法，它是按照以下 步骤进行的：
[0022] 一、外植体的选取：外植体选取野外山桃稠李植株；
[0023] 二、外植体消毒：取带顶芽的侧芽作为外植体剪成4~5cm的带芽茎段，采用洗衣 粉清洗干净，然后再用清水冲洗1~2h;置于超净工作台上用体积百分含量为75%的乙醇 浸泡30s，用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上风干，再用质量百分含量为0. 1 %升汞消毒 8min，然后用无菌水冲洗3次；
[0024] 三、初代培养：将消毒外植体剪成1cm左右的茎段接入初代培养基中培养，培养条 件为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光照时间每天12h，培养30天；所述初代 培养基由改良WPS培养基+浓度为1.Omg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0. 5mg/L的萘乙 酸组成；
[0025]四、不定芽的增殖培养：将初代培养的带芽茎段接入增殖培养基中培养，培养条件 为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光照时间每天12h，培养周期为40天；所述 增殖培养基由改良WPS+浓度为1. 5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0. 5mg/L的萘乙酸组 成；
[0026] 五、壮苗培养：将在增殖培养基中培养至长度达到1cm以上的不定芽逐个切下，接 入1/2改良WPS培养基中培养，培养条件为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光 照时间每天12h，培养周期为40天；
[0027] 六、生根培养：将壮苗培养基中的健康健壮的芽接入生根培养基中培养，培养条件 为：培养温度为20~24°C，光照强度为20001x，光照时间每天12h，培养30天；所述的生根 培养基由1/4改良WPS培养基+浓度为0. 5mg/L的萘乙酸组成；
[0028] 所述的改良WPS培养基由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：
[0029] 所述的大量元素为：（1)浓度为400mg/L的硝酸铵NH4N03、（2)浓度为190mg/L 的硝酸钾KN03、（3)浓度为170mg/L的磷酸二氢钾KH2P04、（4)浓度为370mg/L的硫酸镁 MgS04 ? 7H20 和（5)浓度为 684mg/L的硝酸钙Ca(N03)2 ? 4H20 ;
[0030] 所述的微量元素为：（1)浓度为27. 85mg/L的硫酸亚铁FeS04 ? 7H20和（2)浓度为 37. 28mg/L的乙二胺四乙酸盐Na2EDTA;
[0031] 所述的铁盐为：（1)浓度为22. 5mg/L的硫酸锰MnS04? 4H20、（2)浓度为8. 6mg/L 的硫酸锌ZnS04 ?7H20、（3)浓度为0?25mg/L的硫酸铜CuS04 ?5H20、（4)浓度为6. 2mg/L的 硼酸H3B03和（5)浓度为0?25mg/L的钼酸钠Na具04 ?2H20 ;
[0032] 所述的有机成分为：（1)浓度为0.lmg/L的盐酸硫胺素VBp(2)浓度为0.5mg/L的 盐酸吡哆辛VB6、（3)浓度为0. 5mg/L的烟酸VB5、（4)浓度为2.Omg/L的甘氨酸和（5)浓度 为100mg/L的肌醇。
【具体实施方式】 [0033] 二：本实施方式与一不同的是：步骤一中选取野外山 桃稠李植株是指：选取当年萌发的带顶芽的侧芽茎段为野外山桃稠李植株，将野外采集的 山桃稠李植株置于低温保温箱里储存，备用。其它与一相同。
[0034]
【具体实施方式】三：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：步骤二中外植体消 毒：将采集的小枝条去掉不用的部分，剪成4~5cm的带芽茎段，置于放有洗衣粉水的烧杯 里，用纱布网将烧杯口套住，用手不断晃动烧杯5min，将烧杯用流水冲洗1~2h。其它与具 体实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0035] 四：本实施方式与一不同的是：步骤三、四和五中的 培养基中分别加入浓度为20g/L蔗糖和浓度为6. 5g/L琼脂，pH用氢氧化钠调节至6. 0。其 它与一相同。
【具体实施方式】 [0036] 五：本实施方式与一不同的是：步骤三中所述的初代 培养过程中进行预防褐化。其