一种椎体融合应用的支架材料的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医用骨科材料制备技术领域，具体涉及一种椎体融合应用的支架材料。
【背景技术】
[0002]重组骨形成蛋白rhBMP2在大量的临床循证医学结果表明它的有效性和全身安全性后才被FDA批准上市，应用于脊柱手术的植骨融合。rhBMP2的融合成功率与自体骨相当，接近100%，显著高于其它植骨材料的融合率。但是rhBMP2的应用中存在一些较为明显的问题。其中，在腰椎椎间融合应用中植入早期终板骨溶解现象普遍，这种骨溶解易导致融合器发生沉降或者移位，进而影响手术疗效(如图1所示)。JAMA等知名杂志报道早期终板骨溶解发生率44-100%，融合器沉降率25-40.5%，移位率约27%。
[0003]rhBMP2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一。骨组织生长、发育、代谢，在组织学上表现为骨的生成和骨的重建，在细胞水平上表现为成骨或破骨细胞的分化、增殖、凋亡和转型。此过程非常复杂，涉及多个信号通路和信号分子的参与。回顾文献研究，在rhBMP2对成骨细胞的作用中，有以下几个重要的调控通路:
[0004](I) rhBMP2/Smads/Runx2/0sterix 通路
[0005]Smads/Runx2是rhBMP2发挥作用的一个重要途径。rhBMP2信号主要通过rhBMP2与以异二聚体形式存在的I型和II型苏氨酸/丝氨酸激酶受体结合而传导，激活细胞核上的Smads复合物而调节革E基因；通过Runx2发挥促进成骨的效应。Osterix作为Runx2的下游基因发挥作用，而Runx2作为转录因子还可促进成骨细胞特异性基因，如AKP，OC和一型胶原的表达。
[0006](2) rhBMP2/Smads/Msx2/0sterix 通路
[0007]Matsubara等研究发现，Runx2低表达时，rhBMP2也可以上调Msx2，通过Smads信号传导发挥成骨作用。Msx2能够双向调节成骨细胞的分化，通过上调Osterix来发挥成骨作用。同时Msx2也可以增强Wnt信号通路促进骨源细胞向成骨细胞分化。Msx2这种成骨作用不依赖于Runx，而是直接通过Smads信号传导，激活Osterix发挥作用促进成骨细胞特异性基因表达。
[0008](3) rhBMP2/p38MAPK/Runx2/0sterix 通路
[0009]此途径是与Smads途径并列存在的途径，rhBMP2分子与BMPR结合后，不经过Smads传导，通过p38MAPK激活Runx2/0sterix发挥促进成骨细胞分化和增殖的作用。
[0010]rhBMP2对破骨细胞的影响:
[0011]Kaneko H等报道rhBMP2可以激活破骨细胞的骨吸收作用，并且发现在破骨细胞上有rhBMP2的受体。另外，有学者发现在骨膜分离的原代成骨细胞培养过程中，含有少量的破骨前体细胞。在实验开始并没有破骨分子Calcr，Acp5和Mmp-9的表达，但是在rhBMP2加入后Calcr，Acp5，Mmp-9, Rank和Nfatcl的表达就开始显著增加，并出现越来越多的破骨细胞，表现出显著地骨吸收活性。其机制在于rhBMP2可以上调成骨细胞RANKL的表达，改变RANKL/OPG的比例，升高的RANKL水平可以与破骨细胞或其前体细胞作用，促进破骨细胞增殖和分化，增强骨吸收活性。总之，rhBMP2对破骨细胞较确切的影响机制是可以通过RANKL/0PG途径激活并调节破骨细胞活性。
[0012]由此可见，rhBMP2在激活成骨细胞的成骨功能活性的同时，也激活了破骨细胞的骨吸收作用，这构成了椎间融合手术后椎体溶解、骨吸收的细胞学机制。
【发明内容】
[0013]本发明的目的在于提供一种椎体融合应用的支架材料。
[0014]本发明的目的还在于提供上述椎体融合应用的支架材料的制备方法。
[0015]—种椎体融合应用的支架材料，所述支架材料为在多孔松质骨中掺入锶元素，并附着rhBMP2的复合材料。
[0016]所述掺入锶元素的质量为多孔松质骨的10-15%。
[0017]所述附着rhBMP2的量为每cm3多孔松质骨表面积吸附1800_2500ug。
[0018]—种椎体融合应用的支架材料的制备方法，按照如下步骤进行:
[0019](I)将同种异体骨(FDB)的供体进行软组织去除，骨块切割，低温冷冻初步去除抗原性，然后进一步去净软组织，进行脱脂、脱水、脱细胞、病毒灭活的步骤，-40°C真空冷冻干燥72h，辐照灭菌待用；
[0020](2)将步骤(I)处理好的同种异体骨浸泡入饱和锶溶液中，浸泡12-36小时，取出同种异体骨，采用去离子水冲洗干净，-40°C真空冷冻干燥72h，制成掺锶同种异体骨；
[0021](3)将rhBMP2按照2500ug/cm3的比例与步骤⑵制备的掺锶同种异体骨进行浸泡吸附，浸泡吸附12-36小时，用去离子水洗去未完全吸附的蛋白，真空干燥，分装，三层密封包装，辐照灭菌。
[0022]所述锶溶液为硝酸锶溶液，或者氯化锶溶液。
[0023]所述脱脂、脱水、病毒灭活的操作步骤为:
[0024](I)高压水枪冲洗骨髓油污，采用超临界萃取和超声清洗去脂；
[0025](2)无水乙醇浸泡I小时脱水；
[0026](3) Triton-XlOO和乙醚结合脱细胞；
[0027](4)碘伏浸泡辅助60°C下水浴6小时进行病毒灭活。
[0028]步骤(I)所述辐照灭菌的使用剂量为25KGy，步骤(3)所述辐照灭菌的使用剂量为25KGy0
[0029]本发明的有益效果:Sr元素具有更大的原子质量和电子密度，Sr-FDB与rhBMP2之间的稳定吸附量大于普通的FDB，为后者的1.65倍。具有较普通冻干骨更高的负载活性因子的能力。且Sr元素的掺入使得材料的X线阻射性能更好，因而更加适宜于术中微创透视和术后的疗效观察随访。本发明制备的BMP2-SrFDB在局部通过逆向的离子交换和降解过程释放Sr元素，在体内结合成骨细胞表面的Sr/Ca受体，激活促进成骨细胞增殖的ERK等信号通路，同时实现了调控RANKL表达的蛋白因子，下调RANKL的水平，在局部途径上成功实现了消除BMP2引起的骨溶解并发症问题。本发明促进成骨细胞的功能和活性在体内出现了两者的协同效应，并显著改善了骨生成的效果，在4-8周内实现骨融合。更重要的是尽管细胞内分子作用通路众多，相互交叉，调控繁杂，然而Sr元素和rhBMP2在局部植骨材料中的复合应用，解决了 rhBMP2导致骨溶解的临床问题，增进了 rhBMP2-松质骨复合材料的成骨效果。
【附图说明】
[0030]图1为传统L4/5节段椎间融合内固定术后4个月出现骨溶解现象。
[0031 ] 图2为rhBMP2-FDB的骨诱导活性电镜图。
[0032]图3为rhBMP2-SrFDB的骨诱导活性电镜图。
[0033]图4为比格犬腰椎椎间融合实验CT图。
[0034]图5为比格犬腰椎椎间rhBMP2导致的骨溶解CT图(箭头所示)。
[0035]图6为CT检查rhBMP2-SrFDB材料植入实现比格犬腰椎椎间骨融合，无骨溶解(6周)。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0037]实施例1
[0038]—种椎体融合应用的支架材料，所述支架材料为在多孔松质骨中掺入锶元素，并附着rhBMP2的复合材料。
[0039]所述掺入锶元素的质量为多孔松质骨的10-15%。
[0040]所述附着rhBMP2的量为每cm3多孔松质骨表面积吸附1800_2500ug。
[0041]—种椎体融合应用的支架材料的制备方法，按照如下步骤进行:
[0042](I)将同种异体骨(FDB)的供体进行软组织去除，骨块切割，低温冷冻初步去除抗原性，然后进一步去净软组织，进行脱脂、脱水、病毒灭活的步骤，-40°C真空冷冻干燥72h，辐照灭菌待用；
[0043](2)将步骤(I)处理好的同种异体骨浸泡入饱和锶溶液中，浸泡12-36小时，取出同种异体骨，采用去离子水冲洗干净，-40°C真空冷冻干燥72h，制成掺锶同种异体骨；
[0044](3)将rhBMP2按照2500ug/cm3的比例与步骤(2)制备的掺锶同种异体骨进行浸泡吸附，浸泡吸附12-36小时，用去离子水洗去未完全吸附的蛋白，真空干燥，分装，三层密封包装，辐照灭菌。
[0045]所述锶溶液为硝酸锶溶液，或者氯化锶溶液。
[0046]所述脱脂、脱水、脱细胞、病毒灭活的具体操作步骤为:
[0047](I)高压水枪冲洗骨髓油污，采用超临界萃取和超声清洗去脂；
[0048](2)无水乙醇浸泡I小时脱水；
[0049](3) Triton-XlOO和乙醚结合脱细胞；
[0050](4)碘伏浸泡辅助60°C下水浴6小时进行病毒灭活。
[0051]步骤(I)所述辐照灭菌的使用剂量为25KGy，步骤(3)所述辐照灭菌的使用剂量为25KGy0
[0052]实施例2