一种维生素d与奥美拉唑复合物及其偶联方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，涉及一种新型的药物偶联连接方法，得到一种新型药 物复合物，具体涉及脂溶性维生素D与治疗胃病药物奥美拉唑通过固体光气进行偶联，不 损坏药物活性基础下进行药物稳定性检测以及活性检测，从而可以进一步用于胃上皮细胞 和癌细胞以及动物活体内的药物活性研究，并具有抗癌及促进胃溃疡愈合的作用。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的提高、现代社会生活节奏的加快、生活方式的改变、环境的污 染等诸多因素，癌症已经成为危害人类健康的主要杀手。近年来，虽然肿瘤的诊断、治疗等 研究尽管已经取得了很大的进展，但总体上来看，常见恶性肿瘤的发病率及死亡率仍居高 不下，其中胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国胃癌的发病率居消化道恶性肿瘤的第一 位。
[0003] 维生素D是一种脂溶性维生素，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，它 与阳光有密切关系，所以又叫"阳光维生素"，其中维生素％效应最强。但维生素0 3本身无生 物活性，它被血液中的维生素D结合蛋白运送至肝脏，经肝细胞线粒体内的25-羟化酶系羟 化后形成25-(0H)D3，是维生素D3在血液循环中的主要形式，除了影响钙磷代谢外还对乳腺 癌、肺癌、前列腺癌等癌细胞具有抗肿瘤作用。大量的体内外研究表明，维生素％抑制胃癌 等多种肿瘤的机制可能包括以下几个方面：①通过抑制(6-钙黏蛋白（0-catenin)诱导的 转录，上调P21、P27蛋白的表达从而诱导肿瘤细胞分化及抗增殖；②下调Bcl-2和Bcl-xl 的表达，从而上调前凋亡蛋白Bax和Bak的表达诱导肿瘤细胞凋亡，其中Bcl-2在维生素D 诱导凋亡中起核心作用；③通过上调PTEN基因表达诱导肿瘤细胞凋亡等。
[0004] 由于生活节奏的加快，人们的作息、饮食越来越没有规律，胃炎胃溃疡的发病率逐 年增加，奥美拉唑作为新一代质子栗抑制，是一种新型的抗消化性溃疡药。该药本身是一 弱碱，无活性，但在胃黏膜壁细胞的分泌小管中的次高酸环境下可转化为亚磺胺的活性形 式.然后通过二硫键与壁细胞分泌物中的H+-K+-ATP酶的巯基不可逆的结合，生成亚磺酰胺 与质子栗的复合物，从而抑制该酶活性。奥美拉唑能高度选择性抑制胃部H+K+-ATP酶（质 子栗），从阻止胃酸分泌形成至最后的过程，无论对人体的基础胃酸，还是其它形式的应激 胃酸分泌均可产生强而有效的持久抑制作用。由于奥美拉唑具有疗效显著，复发率低，副作 用少及服用方便等特点，临床应用日趋广泛。
[0005] 近年来在胃癌患者的化疗中，适量联合使用药物，通过协同效应作用于肿瘤细胞， 减少其临床用药剂量，降低其毒不良反应，一直是肿瘤药物治疗的研究热点之一。因此将维 生素D与奥美拉唑在不影响药物活性的条件下进行偶联，合成一种新型的药物复合物，进 一步研究药物活体稳定性及药物活性检测，从而提高药物在活体细胞中的释放浓度，显著 提高药效，从而达到预防和治疗胃炎、胃溃疡和胃癌，降低胃癌发病率及死亡率。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中单独维生素D与奥美拉唑单独作用 效果不好的不足，提供一种维生素D与奥美拉唑的复合物及其偶联方法，进一步提供一种 新型复合物在制备抗胃癌及增进胃溃疡愈合的药物中的应用。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种维生素D与奥美拉唑复合物， 其结构通式为：
[0009] 上述的维生素D与奥美拉唑复合物的偶联方法，包括以下步骤：
[0010] (1)将固体光气溶于无水二氯甲烷溶液中，氮气保护，(TC条件下缓慢加入维生素 D二氯甲烷溶液和三乙胺反应3~4h;
[0011] (2)TLC薄层色谱分析监测直至反应结束，混合溶液旋转蒸发0.5h，加入二氯甲烷 溶解残质，氮气保护，〇°C条件下逐滴加入奥美拉唑二氯甲烷溶液，反应3~5h后，室温搅拌 过夜；
[0012] (3)反应结束后加入NaHCO3水溶液，二氯甲烷萃取，无水NaSO4干燥，硅胶层析柱 分离提纯；
[0013] (4)采用反相高效液相色谱对粗产物进行分离纯化，制得精制品维生素D3与奥美 拉唑的偶联物。
[0014] 三光气（固体光气）在三乙胺、吡啶等亲核试剂（Nu)作用下，1分子三光气可生 成3分子的活性中间体（ClCONu+C厂），它可与各种亲核体在温和的条件下进行反应，其反 应方程式如下：
[0015]
[0016] 三光气与维生素D上的醇羟基反应制得氯甲酸酯中间物，再进一步与奥美拉唑苯 并咪唑基团上相应的仲胺反应可制得氨基甲酸酯类连接复合物。
[0017] 作为优选，步骤⑴所述的维生素D、固体光气、三乙胺摩尔当量比为I:1. 5 :1. 5。
[0018] 作为优选，步骤⑵所述的奥美拉唑与步骤⑴所述的维生素D摩尔当量比为 1. 5:1〇
[0019] 进一步地，所述的反相高效液相色谱流动相A为0. 01 %TFA水溶液，流动相B为 100%乙腈；分离纯化采用梯度洗脱，洗脱程序为：0~5min，5%B;5~IOmin;5%~90% B;10 ~60min，90%B。
[0020] 作为优选，所述的维生素D为维生素％或D3。一种维生素D与奥美拉唑复合物， 可以用于制备抗癌及增进胃溃疡愈合的药物。
[0021] 本发明的有益效果是，本发明中所用三光气作为剧毒的光气和双光气在合成中的 替代物，不但毒性低、使用安全方便，而且反应条件温和、选择性好、收率高；通过维生素D 的醇羟基和奥美拉唑苯并咪唑环上的仲胺进行反应连接，将有可能进一步用于胃上皮细胞 和癌细胞以及动物活体内的药物活性研究，研究表明：本发明的维生素D与奥美拉唑复合 物对人胃癌细胞系（TMK-UMKN-45)有明显的抑制作用，且对正常大鼠胃上皮细胞（RGM-I) 表现出相当或优于对照药物（奥美拉唑或维生素D)的细胞增殖活性，因此本发明可以用于 制备抗癌及促进溃疡愈合的药物。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明维生素D3与奥美拉唑偶联的复合物LC-MS图谱。
[0023] 维生素D3与奥美拉唑偶联复合物的分子量为756. 06,质谱图结果为， [M+l]+756. 70,表明复合物合成正确。
[0024] 图2是采用MTT法测定0ME/VD3偶联药物对人胃癌细胞系（TMK-I)培养48小时 后细胞活性的影响。#，P〈〇. 01 ;*#，P〈〇. 001，相比各自的对照组。
[0025] 图3是采用MTT法测定0ME/VD3偶联药物对人胃癌细胞系（MKN-45)培养48小时 后细胞活性的影响。#，P〈〇. 01 ;*#，P〈〇. 001，相比各自的对照组。
[0026] 图4采用MTT法测定0ME/VD3偶联药物对正常大鼠胃上皮细胞系（RGM-I)的细胞 增殖活性的影响。***，P〈〇. 001，相比各自的对照组。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028] 实施例1维生素D3与奥美拉唑偶联新型药物复合物的合成、纯化及MTT癌细胞毒 性测试。
[0029] (1)维生素D3与奥美拉唑偶联的新型药物复合物的合成，其合成路线如下：
[0031] 称取100mg(0. 26mmol)维生素D3溶于3ml无水二氯甲烷溶液中，在N2环境下 加入三光气11511^(0.39臟〇1)和三乙胺541^(0.39臟〇1)，0°(：搅拌反应3~411直至 反应结束，混合溶液真空干燥0. 5h后溶解在3ml二氯甲烷溶液中，队环境下逐滴加入 134mg(0. 39mmol)奥美拉唑二氯甲烷溶液，0°C下搅拌3~5h后室温反应过夜。加入20ml NaHCO3水溶液，二氯甲烧萃取三次，用饱和盐水冲洗，再用无水Na2S<Vf燥过滤浓缩。
[0032] (2)维生素D3与奥美拉唑偶联的新型药物复合物的纯化
[0033] 先用硅胶层析分离纯化，洗脱液为甲醇和二氯甲烷，体积比1 :100,制得复合物粗 产物。再用高效反相液相色谱提纯，流动相A为0. 01 %TFA水溶液，流动相B为100%乙腈， 梯度洗脱，洗脱程序为：〇~5min，5%B;5~IOmin;5%~90%B;10~60min，90%B，制 得复合物精制品，产率约为80 %。
[0034] (3)采用MTT[3-(4, 5)-二甲基-2-噻唑-(2, 5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定 0ME/VD3复合物对人胃癌细胞系（TMK-UMKN-45)活性的影响。
[0035] 实验方法：
[0036] ?培养液的配制：①悬浮细胞：RPMI1640培养粉一袋（10. 4g)，新生牛血清100mL， 青霉素溶液（2*10 5U/mL) 0. 5mL，链霉素溶液（2*10 5U/mL) 0. 5mL，加三蒸水溶解后，用5. 6% 的NaHCO3溶液调pH至7. 2-7. 4,最后定容至1000mL。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加 入NaHCO3 2. 00g，HEPES2. 38g。
[0037] ?D-Hanks缓冲液（每升）的配制：NaCl8. 00g，KCl0? 4g，Na2HPO4.12H20 0? 06g， KH2PO4 0? 06g，NaHCO3 0? 35g。高压灭菌。
[0038] ?胰蛋白酶的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0. 5%胰蛋白酶液。过滤除 菌。
[0039] 鲁实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，即按实验最