一种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然产物的分离和提取技术领域，尤其涉及一种从红豆杉种子中同步 提取蛋白质和油脂的方法。
【背景技术】
[0002] 红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物的总称，世界上约有11种，主要分布于北半球的 温带至亚热带地区，我国有4个种和1个变种；由于红豆杉中含有抗癌活性物质紫杉醇，红 豆杉已被世界公认为濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。目前，国内外关于红豆杉的研究主要 集中在紫杉醇的开发利用方面，且主要从红豆杉的枝、叶、皮、茎等部位进行提取分离，而关 于红豆杉种子的研究则较少。红豆杉种子作为可再生资源，除含有紫杉醇外，还含有很多其 它活性成分。
[0003] 据研究，红豆杉种子属于油料种子，油脂和蛋白质是种子中的主要贮藏物质，具有 一定的开发利用价值；而目前绝大多数的植物油料种子，都含有丰富的植物油和蛋白质，但 是当前油料种子提油后的残渣基本都被废弃，这就造成了种子中蛋白质资源的极大浪费； 即使油料种子提油后的残渣进行蛋白质提取，一般需要高温脱溶，导致残渣中蛋白质变性， 降低了蛋白质的功能特性和营养特性，而且传统提取蛋白质的工艺繁琐、生产成本高；因此 限制了残渣中蛋白质的深加工和再利用。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种从红豆杉种子中同步提 取蛋白质和油脂的方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0006] -种从红豆杉种子中同步提取蛋白质和油脂的方法，包括以下步骤：
[0007] 构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比（3~5) :1的比例混合摇匀，再加入 表面活性剂氯化双十八烷基二甲基铵（DODMC)，使其均匀分布于有机相，其中有机相中氯 化双十八烷基二甲基铵浓度为0. 05-0. 08g/mL ;溶解完全后加入0. 03-0. 1倍溶液体积比的 氯化钾-磷酸盐缓冲液，混合均匀后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；
[0008] 前萃：将红豆杉种子粉碎后添加到所述反胶束体系，采用变频微波辅助技术进行 前萃，离心分离后得到前萃液和固体残渣；
[0009] 后萃：将所述前萃液与KCl-磷酸盐缓冲液按体积比1: (1-2)的比例混合进行后 萃，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相；
[0010] 产品分离：对所述含蛋白质的水相进行蛋白质分离，对所述含油的有机相进行油 脂分呙。
[0011] 具体地，所述反胶束体系中添加的所述氯化钾-磷酸盐缓冲液的浓度为 0? 05-0. 3mol/L, pH为6. 0-9. 0〇
[0012] 较佳地，所述红豆杉种子粉碎后的目数为60-80目，添加量为0? 01-0. 03g/mL。
[0013]较佳地，所述前萃时采用变频微波辅助技术的萃取时间为20-40min，萃取温度为 30-45。。。
[0014]较佳地，所述后萃中KCl-磷酸盐缓冲液的浓度为I.5-2. 5mol/L,pH为6-9,所述后 萃的时间为60_90min。
[0015]较佳地，产品分离具体包括蛋白质和油的分离以及溶剂的回收，主要根据各类物 质的理化性质进行设计；具体地，所述蛋白质分离为：将所述含蛋白质的水相进行透析，干 燥后得到红豆杉种子蛋白，透析中使用的透析袋截留分子量为3500Da ;采用透析处理含蛋 白的水相，由于种子蛋白的分子量较大，在分离时，盐离子和小分子物质不停扩散到袋外， 而分子量较大的种子蛋白则被截留在袋内，分离蛋白质的过程简单，容易操作，且产品纯度 尚。
[0016] 具体地，所述油脂分离为：将所述含油的有机相，先减压蒸发回收异辛烷，再往余 液中加入约为其2-3倍体积的60%-80% (体积分数）乙醇萃取0.5-lh，得到种子油脂和 乙醇相，将所述乙醇相低温冷冻后，回收低温沉淀的表面活性剂以及剩余的正葵醇；其中， 含油的有机相中还含有异辛烷、D0DMAC、正癸醇，由于异辛烷的沸点为99. 3°C，正癸醇的沸 点为233°C，可以通过减压蒸发首先分离出异辛烷；而种子油几乎不溶于乙醇，DODMC可溶 于乙醇，且在低温下易沉淀，可采用乙醇萃取和低温沉淀相结合的方法进行分离，实现溶剂 和表面活性剂的循环利用。
[0017]本发明的有益效果：
[0018] -方面，采用反胶束萃取技术与传统提取油脂和蛋白质的方法相比，可实现两者 的同步萃取，且原料利用率高，生产工艺简单，成本较低，选择性高，操作方便，工艺条件温 和，其中的溶剂均可以循环使用，对环境友好；且产品得率高，蛋白变性程度小；
[0019]另一方面，采用变频微波辅助反胶束萃取，具有萃取效果好、萃取时间短等优点； 相对于普通微波萃取，随着时间的延长，普通微波萃取会导致萃取温度急速上升，易造成局 部温度过高从而导致蛋白质变性；而变频微波能保持萃取温度的恒定，使萃取更加均匀，且 易于在低温下保持蛋白质的活性。
【附图说明】
[0020] 图1、本发明实施例的工艺路线图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理 解本发明。
[0022] 本发明中，所采用的反胶束体系是表面活性剂分子在非极性有机溶剂中自发形成 具有热力学稳定性的纳米级聚集体，其内部形成"水池"，可溶解水和其它亲水性分子；反胶 束萃取一般包括前萃与后萃两个过程，原料加入反胶束溶液中，在油脂溶于有机溶剂的同 时蛋白质也被萃入反胶束体系中的极性水池内，称为前萃过程；通过调节水相的PH值、离 子强度等因素，促使蛋白质从反胶束的"水池"转入到水相中，称为后萃过程。
[0023]在构建的DODMAC/异辛烷/正癸醇反胶束体系时，首先考虑表面活性剂，由于红豆 杉种子蛋白的等电点在酸性范围，根据反胶束溶液的静电原理，表面活性剂应选取阳离子 型表面活性剂更为合适，而DODMC为季铵盐型阳离子表面活性剂，且季铵盐基团可以与加 溶的水分子通过氢键更好的结合，具有良好的增溶性，因此选择DODMC作为表面活性剂； 而表面活性剂中的溶剂选择主要考虑以下几种，检测结果如表1所示。
[0024]
[0025]表1
[0026] DODMAC-正癸醇-异辛烷的组合，在反胶束体系中，DODMAC不仅溶解迅速，而且萃 取能力强，是一种性能优良的的反胶束体系，因此选其来构建反胶束体系。具体使用在红豆 杉种子的分离提取中详见如下实施例。
[0027] 实施例1
[0028] 一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：
[0029] (1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比为3:1的比例混合摇匀，再加入 适量的表面活性剂DODMC (氯化双十八烷基二甲基铵），使得DODMC浓度为0. 05g/mL，摇 匀，使其均匀分布于有机相；混匀后加入〇. 03倍溶液体积比的KCl-磷酸盐缓冲液，振荡约 5min后，得到澄清、透明、稳定的反胶束体系；其中KCl-磷酸盐缓冲液浓度为0. 05mol/L，pH 值6 ;
[0030] (2)前萃：将红豆杉种子粉碎至60目，干燥后添加到步骤⑴中的反胶束体系，采 用变频微波辅助技术进行前萃，萃取温度30°C，萃取时间30min，萃取完毕后离心分离得到 前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为0.0 lg/mL ;
[0031] (3)后萃：将步骤（2)中取得的前萃液与KCl-磷酸盐缓冲液按体积比1:1混合 进行后萃，萃取时间为60min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相； 其中，该处的KCl-磷酸盐缓冲液浓度为I. 5mol/L，pH值为6 ;
[0032] (4)蛋白质的分离：将步骤（3)获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为3500Da 的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为73. 6 %，萃取出来 的蛋白质纯度为91. 6%。
[0033] (5)油的分离及溶剂回收：将步骤（3)获得的含油的有机相，首先通过减压蒸发回 收异辛烷，再往余液中加入2倍体积的60%乙醇萃取0. 5h，得到种子油和乙醇相，此时种子 油的萃取率为78. 2%，萃取出来的种子油纯度为86. 5% ;将乙醇相于-4°C低温冷冻lh，回 收低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。
[0034] 实施例2
[0035] 一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：
[0036] (1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按5:1的比例混合摇匀，再加入表面活性 剂D0DMAC，使得DODMC浓度为0. 08g/mL，摇匀，使其均匀分布于有机相；溶解完全后加入 0. 1倍溶液体积比的KCl-磷酸盐缓冲液，将混合溶液振荡约IOmin后，得到澄清、透明、稳定 的反胶束体系；其中，KCl-磷酸盐缓冲液浓度为0. 3mol/L，pH值9 ;
[0037] (2)前萃：将粉碎至80目的红豆杉种子干燥完毕后，添加到步骤（1)制得的反胶 束体系中，采用变频微波辅助技术进行前萃，萃取温度45°C，萃取时间40min，萃取完毕后 离心分离得到前萃液和固体残渣；其中，红豆杉种子的添加量为〇. 〇3g/mL ;
[0038] (3)后萃：将步骤（2)中得到的前萃液与KCl-磷酸盐缓冲液按体积比1:2混合 进行后萃，萃取时间为90min，后萃完毕后，离心分离得到含蛋白质的水相和含油的有机相； 其中，KCl-磷酸盐缓冲液浓度为2. 5mol/L，pH值9 ;
[0039] (4)蛋白质的分离：将步骤（3)中获得的含蛋白质的水相使用截留分子量为 3500Da的透析袋进行透析，干燥后得到红豆杉种子蛋白，此时蛋白质的萃取率为75. 2%， 萃取出来的蛋白质纯度为91. 8%。
[0040] (5)油的分离及溶剂回收：将步骤（3)获得的含油的有机相，首先通过减压蒸发回 收异辛烷，再往余液中加入3倍体积的80%乙醇萃取lh，得到种子油和乙醇相，此时种子油 的萃取率为81. 4%，得到的种子油纯度为87. 1%;另外将乙醇相于-4°C低温冷冻2h，回收 低温沉淀的DODMAC以及剩余的正癸醇。
[0041] 实施例3
[0042] 一种从红豆杉种子中同步提取蛋白和油的方法，包括以下步骤：
[0043] (1)构建反胶束体系：将异辛烷和正癸醇按体积比为4:1的比例混合摇匀，再加入 表面活性剂D0DMAC，摇匀，使其均匀分布于有机相，其中DODMC浓度为0. 06g/mL;溶解完全 后加入0. 08倍溶液体积比的KCl-磷酸盐缓冲液，振荡约IOmin后，得