鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体涉及鳄鱼血冻干粉中鳄鱼血多糖的提取方法及其 在肺癌治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 鳄鱼是最古老的爬行动物，在地球上已生存了 2亿3千多万年，因而具有"活化 石"之称。
[0003] 中医古书记载，鳄鱼血具有清热解毒、消炎、消肿瘤等功效。近年来，国外学者对鳄 鱼血的功效进行了研究，已有鳄鱼血具有抗菌、抗病毒等方面作用的报道，而且有助于提升 实验动物在病理条件下的初级免疫应答能力。现代研究表明，鳄鱼血有两大显著的功能特 点：鳄鱼全血、血红蛋白、血清、血浆和白细胞有抗细菌、真菌、病毒和抗癌活性。另一个显著 功能特点是，鳄鱼血红蛋白的携氧量超过其它动物的1〇〇倍以上，这种特殊的血红蛋白进 入人体和人体血红蛋白合成后可提高人体的血液携氧量，将足够的氧送到大脑及身体的各 个部位，增强体液和细胞的活力及抗突变能力。
[0004] 鳄鱼血之所以有如此多的功效，我们认为可能与血液中的多糖有很大的关系，因 为大量研究表明，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的 诊断与治疗等都有着密切的关系，具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。因此我们将鳄鱼血 中的多糖提取出来，进行了抗肿瘤活性的研究。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明旨在提供出一种鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应 用，以解决现有技术中存在的问题。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
[0007] 鳄鱼血多糖，所述鳄鱼血多糖为从鳄鱼血血粉中分离纯化后所得的含至少一种多 糖组分的混合物。
[0008] 进一步的，所述鳄鱼血多糖是在制备治疗或抑制癌症、肿瘤药物中的应用。
[0009] 更进一步的，所述鳄鱼血多糖是在制备抑制肺癌生长及转移的治疗药物中的应 用。
[0010] 进一步的，所述药物可制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少 一种。
[0011] 更进一步的，所述鳄鱼血多糖包含1~3种多糖组分。
[0012] 相对于现有技术，本发明所述的鳄鱼血多糖具有以下优势：
[0013] 所述鳄鱼血多糖为首次从鳄鱼血血粉中提纯的多糖成分，同时所述鳄鱼血多糖与 免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切 的关系，具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用；同时，所述鳄鱼血多糖成分在药学上可与酸、 碱、盐、水合物或酯；以及其他辅料结合制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液、注射液或它 们的组合，作为治疗癌症或肿瘤药物使用，有利于抗肿瘤活性的研究。
[0014] 本发明还提供一种鳄鱼血多糖粗提取物的制备方法，所述制备方法为将鳄鱼血冻 干粉按料液比1 : (20~40)加入蒸馏水中，于超声波细胞破碎机中破碎处理；然后离心3~ 4次合并上清液，加入3~4倍体积的无水乙醇静止过夜，再离心，弃上清液，沉淀用适量无 水乙醇清洗2~3次，离心弃上清液后，用适量乙醚吹打成粉末状，得到鳄鱼血多糖粗提取 物。
[0015] 进一步的，所述蒸馏水为双蒸水。
[0016] 更进一步的，所述离心过程为4°C环境下保持4000~4600rpm/min的离心10~ 20min〇
[0017] 相对于现有技术，本发明所述的鳄鱼血多糖粗提取物的制备方法具有以下优势：
[0018] 本发明利用水沉醇提法处理鳄鱼血冻干粉得到的鳄鱼血多糖粗提取物，可以准确 得出鳄鱼血中的鳄鱼血多糖具有明显提高抗肿瘤功能，并有效地控制肿瘤细胞的生长。
[0019] 除此以外，本发明还提供一种鳄鱼血多糖的单组分纯化分离方法，其中，所述纯化 步骤为将鳄鱼血多糖粗提取物溶于蒸馏水中得到多糖溶液，按1:4的体积比在多糖溶液中 加入氯仿-正丁醇溶液，混合后剧烈振荡20~30min，离心后除去中间层的变性蛋白质， 重复数次至中间层无蛋白质析出为止，然后析出下层多糖溶液，置于透析袋中，透析48~ 72h，不断换水，以除去低聚糖等小分子杂质，然后进行浓缩，最终冷冻干燥得到纯化的鳄鱼 血多糖粉末；
[0020] 所述分离步骤为将纯化的鳄鱼血多糖粉末过葡聚糖凝胶柱进行进一步分离，收集 出峰位置相应洗脱管中的多糖溶液，并合并统一峰型下的多糖，得到1~3种多糖组分。
[0021] 进一步的，所述蒸馏水为双蒸水，所述氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按4:1体 积比混合而成。
[0022] 相对于现有技术，本发明所述的鳄鱼血多糖的单组分纯化分离方法具有以下优 势：
[0023] 采用本发明方法得到的鳄鱼血多糖为纯化分离后的鳄鱼血多糖，含有1~3中多 糖组分，能广泛作为医药、功能食品的原料，治疗效果更显著。同时，本发明提供的制备方法 工艺简单，较易实现产业化生产。
【附图说明】
[0024] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0025] 图1示出了鳄鱼血干粉中提取的多糖粗提取物过S印hadexG-200柱后的洗脱曲 线；
[0026] 图2示出了MTT检测鳄鱼血多糖中三种不同组分对NCI-H446肺癌细胞增殖的抑 制作用；
[0027] 图3示出了MTT检测鳄鱼血多糖中三种不同组分对NCI-H460肺癌细胞增殖的抑 制作用；
[0028] 图4示出了MTT检测鳄鱼血多糖中三种不同组分对A549肺癌细胞增殖的抑制作 用；
[0029] 图5示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSI对NCI-H446细胞迀移的抑制作用；
[0030] 图6示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSII对NCI-H446细胞迀移的抑制作用；
[0031] 图7示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSIII对NCI-H446细胞迀移的抑制作用；
[0032] 图8示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSI对NCI-H460细胞迀移的抑制作用；
[0033] 图9示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSII对NCI-H460细胞迀移的抑制作用；
[0034] 图10示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSIII对NCI-H460细胞迀移的抑制作用；
[0035] 图11示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSI对A549细胞迀移的抑制作用；
[0036] 图12示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSII对A549细胞迀移的抑制作用；
[0037] 图13示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSIII对A549细胞迀移的抑制作用。
【具体实施方式】
[0038] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。
[0039] 其中，实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
[0040] 1.细胞系
[0041] NCI_H446(人小细胞肺癌细胞）：购自南京凯基生物科技发展有限公司；
[0042] NCI-H460 (人大细胞肺癌细胞）：购自南京凯基生物科技发展有限公司；
[0043] A549 (人肺腺癌细胞系）：购自南京凯基生物科技发展有限公司；
[0044] 实验药物与试剂
[0045] 鳄鱼血冻干粉：粉末状，由北京百生康生物科技有限公司提供。
[0046] 四甲基偶氮唑盐（MTT):上海生工生物工程有限公司，货号：TB0799-lg，批号： XP1008B3012J，级别：分析纯，规格lg。
[0047] 二甲基亚砜（DMSO):购自上海生工生物工程有限公司，货号：DN3039A，批号： SJ0731S4013J，级别：分析纯，规格500mL，用于MTT法溶解紫色结晶。
[0048] 二甲基亚砜（DMSO)细胞培养级：购自北京索莱宝科技有限公司，货号： D8370-500,批号：2P005970,级别：细胞培养级，规格500mL，用于细胞冻存，及药物配制。
[0049] RPMI 1640培养基：购自赛默飞世尔科技有限公司，批号：NYG0920,规格：500mL。
[0050] 胰蛋白酶：购自上海生工生物工程有限公司，货号：T0458-10,批号：0301C314,级 另Ij :USP，规格：10g。
[0051]3?主要仪器
[0052] AKTA 系统：GE 公司，型号：UPC-900
[0053] 生物安全柜：西班牙泰事达（Telstar)，型号：Bio II A。
[0054]CO2培养箱：施都凯仪器设备（上海）有限公司，型号：STIK IL-161HI。
[0055] 倒置相差显微镜：厂家：奥林巴斯，型号：CKX41。
[0056] 电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司，型号：AR2202CN;
[0057] 台式冷冻离心机：赛默飞世尔科技公司，型号：ST16R ;
[0058] 超声波细胞破碎机：赛默飞世尔（Thermo Fisher),型号：SCIENTZ-IID;
[0059] 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂，型号：RE_5205;
[0060] 4°C冰箱：青岛海尔股份有限公司，型号：B⑶-192KJ ;
[0061] 涡漩混匀器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QZ-861。
[0062] 4.所用试剂的配制方法包括：
[0063] 四甲基偶氮唑盐（MTT)储液：取MTT粉末I. 0g，溶于200ml磷酸缓冲液（PBS)中， 终浓度为5mg/ml，用0. 22 y m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装，-20°C避光保存。其中， 溶液的配制及使用均应在无菌生物安全柜中操作。
[0064] 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0065] 实施例1鳄鱼血多糖的制备方法
[0066]1、鳄鱼血多糖粗提物的制备
[0067] 称取鳄鱼血冻干粉4. 0g，按料液比1 :20加入相应的双蒸水（ddH20)，于超声波细 胞破碎机中，破碎5min ;4°C离心机中4600rpm/min,离心10min，取上清液，重复3次，合并 上清液，加入3倍体积的无水乙醇静止过夜，4600rpm/min，离心10min后，弃去上清液，沉淀 用适量无水乙醇清洗3次，离心弃上清液后，用适量乙醚吹打成粉末状，得到鳄鱼血多糖粗 提取物。
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