从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物提取技术领域，具体涉及从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法。
【背景技术】
[0002] 金花茶（Camellia chrysantha(Hu)Tuyama)属山茶科山茶属金花茶组植物，被誉 为"茶族皇后"和"植物界大熊猫"。金花茶叶作为广西壮族民间传统的一种中草药，具有 降血糖、降血脂、抑制肿瘤生长、提高机体免疫能力等多种生理功能，其中，金花茶多糖被认 为是重要的功效成分之一。《金花茶多糖抗小鼠免疫性肝损伤作用的研究》（发表于华西药 学杂志，2014, 9(5) :525~527)公开了金花茶多糖的提取方法为：将干燥的金花茶叶粗粉 Ikg加入IOL石油醚回流脱脂提取2次，每次提取I. 5h，挥尽药渣中的石油醚后，沸水提取 2次，每次2h，合并提取液，浓缩至150ml，用氯仿-正丁醇（3:1)多次萃取，得到除去蛋白 质的上清液，加95%乙醇沉淀过夜，抽滤，弃去上清液，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗 涤，即得金花茶粗多糖。经DE52型树脂层析柱洗脱，真空干燥得粉末状金花茶多糖，采用 苯酚-硫酸法显色、紫外-可见分光计测定并计算纯度为69. 16%。该文献还进一步公开 了卡介苗联合脂多糖诱导小鼠出现免疫性肝损伤，当小鼠体内细胞接受到免疫攻击时，表 现为内脏发生损伤，如肝脾肿大造成的指数升高以及免疫低下所致的胸腺缩小，这表明BCG 联合LPS具有对靶器官特异攻击性。经金花茶多糖治疗后，小鼠脏器损伤程度明显减轻，与 HE染色病理学检查的结果一致，这表明金花茶多糖通过恢复机体脏器活性而增强免疫力， 从而抑制肝细胞的免疫毒性。上述文献虽然公开了金花茶多糖具有一定的免疫活性，但是 免疫活性不高。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，该方 法提取得到的金花茶多糖的免疫调节效果比现有的金花茶多糖显著提高。
[0004] 本发明提供的技术方案是从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，包括以下步骤：
[0005] 1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；
[0006] 2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；
[0007] 3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，再加入蛋 白酶酶解，得到酶解液；
[0008] 4)将酶解液置于频率为1000~5000kHz超声波下处理10~60s，然后经截留分子 量为10000的透析袋透析24~72h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析24~ 72h，取透过液浓缩，再加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；
[0009] 5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，活性 炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。
[0010] 步骤1)中，加水提取是指往金花茶叶中加入其重量20~30倍的水，回流提取2~ 3次，每次提取1~3h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液。
[0011] 步骤2)中，将水提液浓缩至60°C下相对密度为I. 1~I. 3的浸膏。
[0012] 步骤2)中，所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90~95v%的乙醇至醇含量为 80 ~85v%。
[0013] 步骤3)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2~4倍，蒸馏水的用量为洗 涤后的沉淀重量的2~4倍。
[0014] 步骤3)中，蛋白酶的用量为金花茶叶干重的0. 3~3%，酶解温度为40~60°C， 酶解时间为1~3h。蛋白酶可以将提取物中的大分子蛋白质酶解为多肽和氨基酸。
[0015] 步骤4)中，将酶解液置于频率为1000~5000kHz超声波下处理10~60s，可以将 分子量极大的多糖（果胶）的部分糖链断开，降低分子量，降低粘度，提高水溶性，增强免疫 活性。超声波处理时间为10~60s是为了确保仅断裂分子量大于50万的多糖，且多糖分 子的断裂程度较小，不破坏活性单元，降低分子量，提高水溶性，并增强免疫活性。
[0016] 超声波处理后的酶解液先经截留分子量为10000的透析袋进行第一次透析，小分 子色素、多肽和氨基酸和蛋白酶将透过透析袋滤除，大大提高保留液的纯度。再将保留液经 截留分子量为500000的透析袋透析24~72h，得到分子量在10000至500000的金花茶多 糖的流出液，所述透过液（流出液）浓缩是指浓缩至60°C下相对密度为I. 1~1. 3的浸膏。 所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90~95v%的乙醇至醇含量为80~85v%。
[0017] 步骤5)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2~4倍，蒸馏水的用量为洗 涤后的沉淀重量的2~4倍。
[0018] 本发明米用超尚频率超声波将分子量极大的多糖分子（分子量在500000以上） 中的部分糖苷键断裂，降低其分子量，降低粘度，提高水溶性，大大增强了终产物的免疫活 性。经检测，终产物的纯度为98. 6%以上。
【具体实施方式】
[0019] 以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
[0020] 实施例1
[0021 ] 1)将金花茶干叶粉碎，加入其重量20倍的水，回流提取2次，每次提取lh，合并提 取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；
[0022] 2)将水提液浓缩至60°C下相对密度为I. 1的浸膏，加入90v%的乙醇至醇含量为 8〇v%，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；
[0023] 3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉 淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2倍，再加入金 花茶叶干重〇. 3%的蛋白酶，在40°C下酶解时间为1~3h，酶灭活，得到酶解液；
[0024] 4)将酶解液置于频率为1000 kHz超声波下处理10s，然后经截留分子量为10000 的透析袋透析24h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析24h，取透过液浓缩至 60°C下相对密度为I. 1的浸膏，加入90v%的乙醇至醇含量为80v%，静置沉淀，抽滤，取沉 淀物备用；
[0025] 5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均 为沉淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2倍，活性 炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98. 6%。
[0026] 实施例2
[0027] 1)将金花茶干叶粉碎，加入其重量30倍的水，回流提取3次，每次提取3h，合并提 取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；
[0028] 2)将水提液浓缩至60°C下相对密度为1. 3的浸膏，加入95v%的乙醇至混合液中 醇含量为85v %，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；
[0029] 3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉 淀物重量的4倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，再加入金 花茶叶干重3%的蛋白酶，在60°C下酶解时间为3h，酶灭活，得到酶解液；
[0030] 4)将酶解液置于频率为5000kHz超声波下处理60s，然后经截留分子量为10000 的透析袋透析72h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析72h，取透过液浓缩至 60°C下相对密度为1.3的浸膏，加入95v%的乙醇至醇含量为85v%，静置沉淀，抽滤，取沉 淀物备用；
[0031] 5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均 为沉淀物重量的4倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，活性 炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98. 8%。
[0032] 实施例3
[0033] 1)将金花茶叶粉碎，加入其重量25倍的水，回流提取2次，每次提取2h，合并提取 液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；
[0034] 2)将水提液浓缩至60°C下相对密度为1. 2的浸膏，加入90v%的乙醇至混合液中 醇含量为SOv %，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；
[0035] 3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉 淀物重量的3倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的3倍，再加入金 花茶叶干重1. 5%的蛋白酶，在50°C下酶解时间为2h，酶灭活，得到酶解液；
[0036] 4)将酶解液置于频率为3000kHz超声波下处理40s，然后经截留分子量为10000 的透析袋透析48h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析48h，取透过液浓缩至 60°C下相对密度为1.2的浸膏，加入90v%的乙醇至醇含量为80v%，静置沉淀，抽滤，取沉 淀物备用；
[0037] 5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均 为沉淀物重量的3倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的3倍，活性 炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98. 7%。
[0038] 实施例4
[0039] 1)将金花茶叶粉碎，加入其重量20倍的水，回流提取3次，每次提取lh，合并提取 液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；
[0040] 2)将水提液浓缩至60°C下相对密度为1. 3的浸膏，加入90v%的乙醇至混合液中 醇含量为85v%，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；
[0041] 3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉 淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，再加入金 花茶叶干重〇. 3%的蛋白酶，在60°C下酶解时间为lh，酶灭活，得到