一种干细胞球切割收集装置及干细胞球的切割分离传代方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种干细胞球切割收集装置及干细胞球的切割分离传代方法。
【背景技术】
[0002]在培养神经干细胞或神经前体细胞，肿瘤干细胞，胚胎干细胞时，常常出现干细胞团块或称干细胞球，在长期培养中传代都使用胰蛋白酶或胰蛋白酶加Η)ΤΑ的分离细胞球的方法分离传代。由于长期使用这些酶的化学分离法对细胞膜受体产生不同程度的损伤，严重影响长期培养中干细胞的寿命。神经系统疾病的发生和发展是由于神经细胞数量减少或功能改变造成的。通过移植神经干细胞可治疗相关神经退行性疾病。胚胎干细胞不但在作用机制等研究领域中起到很重要的作用，而且在多种疾病防治中也有极其重要的作用。培养肿瘤干细胞在研究肿瘤发生和防治中起到重要作用。所以一种快速简便的、不损伤细胞的干细胞球分离法十分重要。
[0003]神经干细胞是一种多能干细胞，在相关细胞因子刺激下，可在体外增殖并形成特殊的球状结构，此球状结构被称为神经球。神经球具有特殊的微环境，可保持球内干细胞的存活和增殖，并赋予神经干细胞向外胚层细胞(神经元和神经胶质细胞)分化的潜能。神经球的制备是神经干细胞治疗的关键步骤，它们的质量直接影响到神经干细胞临床的治疗疗效。
[0004]目前常用的方法包括酶消化法或机械吹打法。酶消化法是利用单独胰酶或胰酶与EDTA合用的方法消化神经球。研究显示酶消化法可导致干细胞发生突变，也存在操作时间长和细胞损伤大等缺点。机械吹打法采用滴管或移液管对组织进行反复吹打，尽管操作时间短，但同样对细胞损伤大。并且所得到的细胞团块大小不均，导致部分神经球体积过大，影响神经干细胞的存活、生长和分化。最近有人用锋利刀片切割法，这种方法比以前的方法有大的改进，但是可以造成很多细胞碎片，这些碎片可能会影响干细胞的正常生长发育。因此，建立一种简便、快速、无诱发基因突变、对细胞损伤较小以及可制备大小均匀的神经球的制备方法，是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明为解决神经干细胞传代过程导致的神经干细胞易发生细胞凋亡、突变、细胞损伤、神经干细胞分化以及操作时间长和神经球大小不均一等问题，提供一种干细胞球切割收集装置。
[0006]本发明还提供利用上述装置进行的具有简便、快速、无诱发基因突变、对细胞损伤较小的干细胞球的切割分离传代方法。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种干细胞球切割收集装置，该装置包括干细胞球切割器、干细胞球收集瓶和具有正压和负压双向抽气功能的抽气栗，干细胞球切割器和干细胞球收集瓶之间由管路连接，该干细胞球切割器具有一管体，管体内固定两个间隔设置的筛网。
[0008]作为优选，所述的筛网为不锈钢筛网，两个筛网的孔径分别为350±40 μπι和104±20μπι，孔径较大的筛网靠近干细胞球收集瓶。作为优选，两个筛网之间的距离为20mm。进一步的，两个筛网的孔径分别为350±10 μπι和104±5 μm，孔径的大小控制对干细胞球的切割具有重要意义。
[0009]作为优选，该装置还包括空气缓冲瓶、三通管、培养瓶和切割后小干细胞球收集瓶，抽气栗与空气缓冲瓶通过管路连接，空气缓冲瓶与干细胞球收集瓶通过管路连接，培养瓶和干细胞球收集瓶通过管路分别与三通管的两个接口相连，三通管的第三个接口与干细胞球切割器连接。该结构用于干细胞的大规模培养。
[0010]作为优选，干细胞球切割器的出口端设有一个缩口的连接管。
[0011]—种干细胞球切割收集装置，该装置包括注射器和与注射器相连的干细胞球切割器，该干细胞球切割器具有一管体，管体内固定两个间隔设置的筛网。所述的筛网为不锈钢筛网，两个筛网的孔径分别为350±40 μπι和104±20 μπι，孔径较大的筛网靠近干细胞球收集瓶。
[0012]一种干细胞球的切割分离传代方法，该方法包括如下步骤:a.采用所述的干细胞球切割收集装置对干细胞球进行切割分离:将含有干细胞的培养液吸入干细胞球收集瓶后，利用流体压力使干细胞球经细胞球切割器钝性切割成小干细胞团块，然后进入培养瓶内，培养瓶内预置细胞培养液；b.将a步骤获得的含有小干细胞团块的细胞培养液进行分瓶培养；c、分瓶培养时，每3-7天更换一次新鲜细胞培养液，每20-30天重复a步骤对干细胞球进行切割分离。
[0013]作为优选，所述干细胞球为神经干细胞，神经干细胞球的直径达到500-2000 μπι大小时用干细胞球切割收集装置将每一个神经干细胞球切割成3-8小块，进行1:2、1:4或1:6分瓶传代培养。
[0014]常规方法培养神经干细胞(神经球)时，用胰蛋白酶或其它胶原酶把神经球消化成单个细胞进行传代培养。每I至2周传代培养一次，随着传代次数增加，培养的神经干细胞数量逐渐减少(即缓慢死亡)。常规“胰蛋白酶消化”方法或用“胰蛋白酶+乙二胺四乙酸二钠(EDTA)消化”法或胶原酶消化法都很难把神经干细胞(神经球)传代培养超越三个月。分析原因如下:1.胰蛋白酶能够解离和破坏每个细胞之间的连接和轻微损伤细胞膜受体，在细胞内可以切去C端肽段，可特异性地水解蛋白精氨酸、赖氨酸残基右侧肽健等作用。如果少量使用或一次使用胰蛋白酶对细胞生长的危害较小，对子代细胞甚至几乎没有明显影响，因为细胞自身修复系统起作用。但如果多次使用胰蛋白酶消化分离细胞，造成细胞的损害已经超出细胞自身修复系统的能力，所以培养的神经干细胞数量逐渐减少；2.用胰蛋白酶把神经球消化成单个细胞后，又需要用血清阻止胰蛋白酶的活性，而血清中含有很多促细胞分化因子，所以，按传统方法培养神经干细胞时，经常遇到大量神经干细胞分化成神经元和胶质细胞(星形胶质细胞和少突胶质细胞)，分化后的神经元在体外培养后自然老化死去，因为神经元是终末细胞，它无细胞分裂功能。即使分化后的星形胶质细胞和少突胶质细胞能够分裂成子细胞而存活下去，但是在一般条件下，星形胶质细胞和少突胶质细胞不可能逆向分化成神经干细胞，更没有神经干细胞分化成神经元的功能。所以按常规方法无法长期培养神经干细胞。
[0015]用酶消化分离细胞法是对每一个细胞都会产生或多或少的影响，而本发明的“细胞球切割刀”分离干细胞球法进行传代培养，对极大部分细胞是无任何损害的，但是对机械刀切割到的极小部分细胞是有损害或致命的，这极小部分致命的细胞自行死去，并随着新旧培养液更换，随着旧培养液而废除。这对传代后的新干细胞无明显影响。因此，细胞球切割刀分离干细胞球法是培养干细胞的好方法，也是本发明在体外长期培养扩增干细胞方法的关键因素之一。
[0016]本发明解决了体外培养神经干细胞易分化和易死亡的技术难题，达到长期培养扩增人神经干细胞的目的，而且人神经干细胞的特性稳定，质量可控，为广泛应用于临床提供重要的、用之不竭的神经干细胞资源。本发明人根据此法已经对神经干细胞连续培养3年多时间。本发明中干细胞球切割收集装置可以用于任何细胞球的切割分离传代培养实验研究和规模化生产中。
【附图说明】
[0017]图1是本发明干细胞球切割收集装置吸入干细胞球时的结构示意图；
图2是本发明干细胞球切割器的结构示意图；
图3是本发明干细胞球切割收集装置切割神经球时的结构示意图；
图4是本发明干细胞球切割收集装置的另一种结构示意图；
图5为切割前的神经干细胞球的显微照片，
图6为神经干细胞球切割成小块的显微照片，
图7为显微镜放大400倍的单个神经干细胞和小团块显微照片；
图8为神经干细胞球切割后培养30天显微照片；
图中:1、抽气栗，2、空气缓冲瓶，3、干细胞球收集瓶，4、三通管，分离管路，5、培养瓶，6、干细胞球切割器，7、筛网，8、