一种拟茎点霉菌的快速诱导产孢方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原菌诱导产孢领域，具体涉及一种拟茎点霉菌的快速诱导产孢 方法。
【背景技术】
[0002] 拟茎点霉属（Phomopsis)真菌是半知菌门、腔孢纲、球壳孢目、球壳孢科真菌中的 一个大属，含有100多个不同的种，可寄生于70多种不同科的草本和木本植物，引起大量作 物的严重病害，如茄子褐纹病、芦笋茎枯病、芒果褐腐病等。此外，该属中部分种还以植物 重要内生真菌形式存在，具有一定的经济重要性。近年来关于拟茎点霉菌的分类鉴定、致 病性及致病机理等研究逐渐引起关注，而诱导产孢一直是分类鉴定研究中的关键环节，如 何快速简易地获得大量孢子在很大程度上决定着研究的进展及成败。纯培养真菌诱导产 孢的主要方法是利用日光或近紫外光照射、低温、加大湿度、水洗、扫刷营养体、改用贫瘠的 培养基等方式破坏其正常的生长环境，或在菌丝体上放置宿主植物组织等诱导其产孢。但 目前针对拟茎点霉菌的诱导产孢技术鲜有报道，仅罗利娟等（2004)年【菌物学报23(2): 219-225】对8种拟茎点霉菌纯培养的产孢条件进行了筛选比较，最终确定苜蓿煎汁+查彼 克（Czapek)培养基为最佳诱导培养基，最佳培养基PH值为5. 6~6. 8,但培养制作方法相 对较繁琐，不易操作。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种拟茎点霉菌的快速诱导产孢方法及其应用，即利用简易 可行的方法快速诱导拟茎点霉菌菌丝体产孢，从而为加快后续的孢子形态观察及致病性的 相关研究奠定良好基础，并为广大科研工作节约大量的宝贵时间。
[0004] 具体要求是：
[0005] 提供一种拟茎点霉菌的快速诱导产孢方法的详细步骤；
[0006] 展现上述方法较其它诱导产孢方法相比的优点；
[0007] 提供上述方法在拟茎点霉菌菌丝体快速诱导产孢中的实际应用情况。
[0008] 本发明的目的是这样实现的：
[0009] 通过运用本方法与9种真菌常用的诱导产孢方法，对27个拟茎点霉菌菌株（对应 9个不同的拟茎点霉菌种）进行诱导产孢，基于每皿上的载孢体数量指标，证实本方法的实 用性及可靠性；拟茎点霉菌的快速诱导产孢方法在很大程度促进了该菌的孢子形态观察、 分类及致病性的相关研究，有着重要的理论学术意义和较高的经济价值。
[0010] -、拟茎点霉菌的快速诱导产孢方法
[0011] 以PDA固体培养基培养的拟茎点霉菌菌丝体为产孢的基础，通过扫刷菌苔、无菌 水冲洗、干燥及恒温光照培养措施，诱导菌丝体在4天内迅速萌发大量载孢体；
[0012] 具体包括下列步骤：
[0013] ①将分离得到的拟茎点霉菌菌株转接到PDA(马铃薯琼脂）培养基平板上，进行活 化，置于28°C恒温培养箱中避光培养3~4d，待菌落生长至培养皿边缘时，用于诱导产孢研 究，PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至IL ;
[0014] ②在超净工作台中于PDA平板上倒入ImL无菌水，用无菌毛笔蘸无菌水浸润变软 后扫刷菌苔，表面冲洗3次后，将无菌水倒出，平板倒扣自然晾干；
[0015] ③将晾干后的PDA平板重新盖上盖子后，置于28°C的恒温培养箱中光照培养4d ;
[0016] ④光照4d后，在平板表面看见白色至灰色的载孢体，计算载孢体的形成数量。
[0017] 其工作机理是：
[0018] 利用日光照射刺激、水洗扫刷营养体等方式破坏真菌菌丝的正常生长环境，诱导 其在短时间内大量产孢。
[0019] 二、拟茎点霉菌的快速诱导产孢方法的应用
[0020] 分别利用拟莖点霉菌属9个不同种P. lithocarpus、P. liquidambari、 P. bombacis、P. euphorbiae、P. mangiferae、P. destructum、P. psidii、P. asparagus、 P. sterculicola于干燥保存、活化状态下菌丝体的快速产孢。
[0021] 通常在4d内即可迅速产孢，每皿上明显突出的载孢体可基本达到120个以上。
[0022] 本发明具有下列优点和积极效果：
[0023] ①通过光照刺激及扫刷菌苔等方式，诱导拟茎点霉菌菌丝体在4d内快速产生大 量的载孢体；
[0024] ②利用光照刺激及扫刷菌苔等方式，能快速简易地诱导纯培养菌丝产孢用于真菌 的形态鉴定，为其它真菌的诱导产孢技术开发提供了重要的实践经验；
[0025] ③用于拟茎点霉菌的快速简易诱导产孢，将大大提高其产孢效率，缩短鉴定周期， 有效节约了人力物力及科研工作者的大量宝贵时间，具有很大的应用潜力和较高的经济价 值。
【附图说明】
[0026] 图1为P. Iithocarpus菌株在PDA培养基上的正常菌落形态；
[0027] 图2为P. Iithocarpus菌株在PDA培养基上经本方法诱导产孢后的菌落形态；
[0028] 图3为P. Iiquidambari菌株在PDA培养基上经本方法诱导产孢后的菌落形态；
[0029] 图4为P. euphorbiae菌株在PDA培养基上经本方法诱导产孢后的菌落形态。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图和实施例详细说明：
[0031] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手 段。
[0032] 一、方法
[0033] 1、拟茎点霉菌菌株
[0034] 拟莖点霉菌菌株包括9个不同种的菌株P. lithocarpus、P. liquidambari、 P. bombacis、P. euphorbiae、P. mangiferae、P. destructum、P. psidii、P. asparagus、 P. sterculicola〇
[0035] 2、本方法与其它诱导产孢方法（对照方法）的比较
[0036] 试验地点：中国科学院武汉植物园猕猴桃资源与育种学科组植物保护研究室
[0037] 试验时间：2015年5~8月
[0038] 试验材料：隶属于 P. lithocarpus、P. liquidambari、P. bombacis、P. euphorbiae、 P. mangiferae、P. destructum、P. psidii、P. asparagus、P. sterculicola 9 个不同种的拟莖 点霉菌菌株，每个种3个菌株，共计27个菌株。
[0039] 试验方法：
[0040] 预处理：将分离纯化的27个菌株活化后转接于PDA平板上，每个菌株转接15个 PDA平板，28°C避光培养3~4d，待菌落生长至培养皿边缘时，用于诱导产孢研究；PDA固体 培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1L。
[0041] 本方法：取每个菌株的3个PDA平板，在平板上倒一层无菌水，用无菌毛笔蘸无菌 水浸润变软后扫刷菌苔，随即将水倒掉，平板倒扣自然晾干，再将平板置于光照条件下28°C 培养4d，计算载孢体的形成数量。
[0042] 对照方法1 :取每个菌株的3个PDA平板，光照条件下28°C培养4d，计算载孢体的 形成数量。
[0043] 对照方法2 :取每个菌株的3个PDA平板，在平板上倒一层无菌水，用无菌毛笔蘸 无菌水浸润变软后扫刷菌苔，随即将水倒掉，平板倒扣自然晾干，再将平板置于光照条件下 4°C培养4d，计算载孢体的形成数量。
[0044] 对照方法3 :取每个菌株的3个PDA平板，在平板上倒一层无菌水，用无菌毛笔蘸 无菌水浸润变软后扫刷菌苔，随即将水倒掉，平板倒扣自然晾干，再将平板置于紫外光条件 下28°C培养4d，计算载孢体的形成数量。
[0045] 对照方法4 :取1个PDA平板，从P