一种高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的里氏木 霉菌株的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] α -半乳糖昔酶（a -D-galactoside galactohydrolase ;EC 3. 2. 1. 22)是一种外 切糖苷酶，能特异性水解糖链非还原末端的α-l，6-半乳糖苷键。它能够催化含α-半乳 糖苷键的寡糖水解，如蜜二糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等，同时还能够催化含该键的杂多 糖水解，如α -半乳甘露聚糖等。已有研究表明，α-半乳糖苷酶在工业中有着巨大应用 前景。比如饲料工业中，α-半乳糖苷酶能够有效除去豆柏饲料中的抗营养因子，提高饲料 中营养物质的利用率；制糖工业中，α -半乳糖苷酶能够提高蔗糖得率，降低制糖成本；造 纸业中，α -半乳糖苷酶能够协同甘露聚糖酶的作用提高纸张的漂白效果；在医疗行业中， α -半乳糖苷酶在治疗Fabry病和Schindler病以及血型改造方面都有着重要的应用价值。
[0003] α -半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物及微生物中，但与微生物相比，动植物体内 该酶的含量少且提取纯化工艺复杂。目前α-半乳糖苷酶主要来源于黑曲霉及青霉，但利 用原菌株发酵的产量较低，成本较高。近年来利用基因工程技术克隆新的α-半乳糖苷酶 基因并在常用表达宿主中表达已成为主要研究趋势，且酶的产量与原菌株相比有较大提高 (表1)。其中毕赤酵母中表达的α-半乳糖苷酶产量最高，酶活特异性好，但仍未达到工业 生产水平，发酵过程中需转接且需要用大量的甲醇进行诱导，程序繁琐，成本高，更为重要 的是巴斯德毕赤酵母不是FDA认证的GRAS微生物，生物安全性存在隐患，不适用于食品医 疗中的应用。因此，开发安全性高、发酵提纯工艺简单、成本低的新的表达系统是十分必要 的。
[0004] 里氏木霉（Trichoderma reesei)是美国FDA认证的安全生产菌株，蛋白表达分泌 能力强，某些突变株的胞外蛋白分泌量可达到l〇〇g/L，并且具有与高等哺乳动物相似的糖 基化修饰系统，因此里氏木霉非常适合表达真核来源的药用、食品级蛋白。
[0005] 表1、近期不同宿主表达α -半乳糖苷酶的相关研究
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种重组菌。
[0008] 本发明提供的重组菌，为如下1)或2):
[0009] 1)所示的重组菌是将扬奇青霉α -半乳糖苷酶的编码基因导入宿主里氏木霉菌 Trichoderma reesei，得到的菌；
[0010] 2)所示的重组菌是将扬奇青霉α -半乳糖苷酶的编码基因和筛选标记基因导入 宿主里氏木霉菌Trichoderma reesei，得到的菌；
[0011] 所述扬奇青霉α -半乳糖苷酶的氨基酸序列为序列3。
[0012] 上述重组菌中，所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因是通过表达扬奇青霉 α-半乳糖苷酶的重组载体导入宿主里氏木霉菌；
[0013] 上述重组菌中，所述表达扬奇青霉α -半乳糖苷酶的重组载体为 pSK-Pagl-Histag 重组载体；
[0014] 所述pSK-Pagl-Histag重组载体是将所述扬奇青霉α -半乳糖苷酶的编码基因插 入pSK-Pcbhl-sig-Tcbhl载体的多克隆位点得到的。
[0015] 上述重组菌中，所述筛选标记基因为pyr4基因。
[0016] 上述重组菌中，所述pyr4基因是通过pSK-pyr4重组载体导入宿主里氏木霉菌；
[0017] 所述pSK_pyr4重组载体是将pyr4基因插入pBluescript SK(+)载体的多克隆位 点得到的。
[0018] 上述重组菌中，所述扬奇青霉α -半乳糖苷酶的编码基因的核苷酸序列为序列1 ; 所述pyr4基因的核苷酸序列为序列2。
[0019] 上述重组菌中，所述里氏木霉菌为尿嘧啶缺陷型里氏木霉菌。
[0020] 本发明的另一个目的是提供上述重组菌的新用途。
[0021] 本发明提供了上述重组菌在生产α -半乳糖苷酶中的应用。
[0022] 本发明还提供了上述重组菌在提高α -半乳糖苷酶活力中的应用。
[0023] 本发明的最后一个目的是提供一种生产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的方法。
[0024] 本发明提供的生产扬奇青霉α -半乳糖苷酶的方法包括如下步骤：发酵培养上述 重组菌，得到所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶。
[0025] 上述方法中，所述培养的条件为30°C培养7天。
[0026] 上述方法中，所述发酵的培养基为玉米浆工业发酵培养基；所述玉米浆工业发酵 培养基由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质在所述玉米浆工业发酵培养基中的浓 度为玉米芯I. 5g/30ml ;麸皮0· 9g/30ml ;玉米浆L 5% (体积分数）。
[0027] 本发明去除了扬奇青霉α -半乳糖苷酶基因自身的信号肽序列，选用了里氏木霉 cbhl基因的启动子、信号肽及终止子来构建表达载体，将来自扬奇青霉的α -半乳糖苷酶 基因定点整合到里氏木霉基因组中的高效表达位点一一cbhl基因位点，得到高产扬奇青霉 α -半乳糖苷酶的里氏木霉菌株，利用里氏木霉cbhl强启动子及其信号肽序列在里氏木霉 中实现了扬奇青霉α -半乳糖苷酶的高效分泌表达。通过试验证明：对高产扬奇青霉α -半 乳糖苷酶的里氏木霉菌株进行发酵获得的发酵液的酶活力单位可达到119. 16U/ml。本发明 的发酵工艺简单，只需将孢子液接种至玉米芯发酵培养基中即可，不需转接，且本发明的原 料廉价易得，大大降低成本，非常适合工业生产及应用。
【附图说明】
[0028] 图1为里氏木霉α -半乳糖苷酶表达菌株阳性转化子的PCR鉴定结果。图IA为 里氏木霉α-半乳糖苷酶阳性转化子的PCR验证示意图；图IB为阳性转化子的PCR验证 核酸电泳图。其中，1-4泳道为阳性转化子的PCR结果，5-8泳道为Λ tku70菌株的PCR结 果，1、5为Pagl orf片段验证，2、6为Pagl up片段验证，3、7为Pagl down片段验证，4、8 为cbh Iorf片段验证。
[0029] 图2为里氏木霉α -半乳糖苷酶表达菌株阳性转化子的SDS-PAGE鉴定。其中， 1为对照菌株Λ tku70菌株的发酵168h结果，2-7为阳性转化子pagl6发酵48h、72h、96h、 120h、144h、168h 结果。
[0030] 图3为里氏木霉重组表达纯化的α半乳糖苷酶的SDS-PAGE鉴定。其中，1为纯化 前样品，2为纯化穿透，3和4为纯化后样品。
[0031] 图4为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶最适温度。
[0032] 图5为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶温度稳定性。
[0033] 图6为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶最适pH。
[0034] 图7为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶pH稳定性。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 下述实施例中的里氏木霉Λ tku70菌株为尿嘧啶缺陷型菌株，作为α-半乳糖 苷酶的表达宿主，在文献 "Zhang Guangtao, Lukas Hartl, Andre Schuster, et al. Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocrea jecorina. Journal of Biotechnology, 2009, 139:146-151"中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
[0038] 下述实施例中的pBluescript SK (+)购买自Stratagene公司，产品目录号 VKS0288。
[0039] 下述实施例中的MM培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在MM培养基中 的质量分数为：(NH4)2SO4 0· 5% !KH2PO4 I. 5% ;MgS04 0· 06% ;CaCl2 0· 06% ;FeS04 · 7H20 0· 0005% ;MnS04·H2O 0.00016% ;ZnS04.7H20 0.00014% ;CoC12 0.0002% ;调 ρΗ5· 3,115°C 高压蒸汽灭菌。
[0040] 下述实施例中的LB培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在LB培养基中 的质量分数为：蛋白胨1% ;氯化钠1% ;酵母提取物〇. 5%，自然pH，121°C高压蒸汽灭菌。
[0041] 下述实施例中的pNPG溶液（15mM)的制备方法：准确称取0. 45189g pNPG (对硝基 苯a -D-吡喃半乳糖苷），溶解到蒸馏水中定容至100ml。
[0042] 下述实施例中的IOO