具有氨苄青霉素抗性的乳酸菌及其制剂的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别涉及具有氨苄青霉素抗性的乳酸菌及其制剂的制 备与应用。
【背景技术】
[0002] 在人体定居着大量的微生物，其中主要的就是细菌类，正如我们所知道的它能够 定居在人体肠道中，形成复杂的群体或者微生态体系。据统计健康成人的肠道栖息着1014 个细菌，是人体细胞总数的10~20倍，有多达近500余种细菌，肠道细菌是人体最庞大、最 重要的组成部分，平均每1克大便的细菌数量达到1〇12。机体的宿主细胞、肠道微生物和其 他微生物构成了一个复杂的系统，相互影响形成了多种生物学效应。
[0003] 肠道益生菌（Probiotic)是一类与宿主互利共生、有利于宿主健康的肠道细菌。 当前，国内外普遍公认的安全性益生菌菌种主要为乳杆菌属Lactobacillus和双歧杆菌属 Bifidobacterium，这两类菌可以在健康成年人的肠道菌群中出现。其他用作益生菌的还有 链球菌 Streptococcus sp.、乳球菌 Lactococcus sp.、肠球菌 Enterococcus sp.、拟杆菌 Bacteroides sp·、芽抱杆菌 Bacillus sp·、丙酸菌 Propionibacterium sp.及真菌 Fungi 等。
[0004] 肠道益生菌成分组成了机体重要功能，负责3个主要功能：抵制病原微生物的定 植；提供营养；免疫调节。益生菌能够结合肠道上的位点，抑制病原微生物的结合，这种潜 在的机制可能是有益菌能够产生保护效应抵制病原菌，包括竞争营养或者附着位点，产生 抑制新城代谢和抗病原菌作用，调节毒素的产生和活性。有益微生物通过提高日常饮食多 糖的分解效应和提供维生素，从而有助于为宿主提供营养。许多研究已经证实益生菌能刺 激与获得性免疫相关的功能，激活淋巴细胞并刺激抗体生成，能提高机体的特异性及非特 异性免疫功能，对腹泻、炎症、心血管疾病、肥胖等都具有潜在应用价值。
[0005] 由于抗生素能杀死细菌，在疾病的救治中也发挥了不可替代的作用，在医疗领域 得到了广泛的应用。但是，长期使用抗生素及抗生素的滥用，使许多人肠道致病细菌获得耐 药性，同时也抑制体内的有益菌，使肠道菌群失衡，从而引起疾病的发生。抗生素所致的肠 道生态平衡的改变，可能会导致生态系统抗移植性的丢失和肠病原的过度繁殖，耐药性菌 株和条件致病菌的过度生长，有益微生物的抑制，改变肠道生物菌群的功能。
[0006] 抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhea，AAD)是抗生素破坏了肠 内菌群的自然生态平衡，即生理性细菌明显减少而需氧性菌及兼性厌氧菌数量增加，引起 了肠道黏膜损伤和炎症。益生菌已被用于治疗和预防AAD的使用，根据结果临床试验，补 充益生菌在多种抗生素治疗幽门螺杆（Helicobacter pylori)感染的根除已被提出作为 一个潜在的方法。Taomola E等采用对照试验研究了 LGG酸奶对红霉素（erythromycin) 引起腹泻的防止作用，结果发现LGG在接受红霉素治疗的病人体内能够定植，能够降低红 霉素引起的腹泻发生率，同时也能减轻由红霉素引起的胃病和肠胃气胀等其他副反应的 发生（Taomola E，Crittenden R, Playne M，et al. Quality assurance criteria for probiotic bacteria, the American journal of clinical nutrition，2001，73(2Suppl)： 393S-398S)。Richard等给32名复发行艰难梭菌腹泻患者服用上Lactobacillus GG冻干 菌粉，其中27个病人一次性治愈，5个病人在治愈10天后复发，但其中3人经再次治疗而治 愈，其他2人因失去追踪而宣告失败，这足以说明LGG是治疗复发性艰难梭菌腹泻的安全有 效的方法（Richard G. Bennett, Shrewood L. et al. Treatment of relapsing clostridium difficile diarrhea with Lactobacillus GG. Nutrition today 31 (Suppl) :35S_38S)〇 E. J. V i d e I o c k等采用双盲、安慰剂对照试验，对413 8名医院的接受抗生素治疗的病人 用益生菌和空白处理，结果益生菌组与安慰剂组患者相比，发生AAD的合并相对危险 度（RR)为 0.53 (95 % CI 0.44-0. 63)，相应的需要治疗人数（NNT)为 8 (95 % CI 7-11)， 益生菌的预防效应显著（E.J.Videlock，F. Cremonini. Meta-analysis: probiotics in antibiotic-associated diarrhoea. Alimentary Pharmacology and Therapeutics， 2012, 35(12) :1355-1369)。
[0007] 目前常用的微生态活性制剂大都对抗生素敏感，根据王君耀等人的研究（王君 耀，赵锋.3种微生态制剂与常用抗菌药物的相互作用[J].中国医院药学杂志，2003， 23 (7))，双歧杆菌对青霉素、氨苄西林、苯唑西林、阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻肟、环丙沙 星、氧氟沙星、庆大霉素、呋喃妥因、复方磺胺甲恶唑、四环素、红霉素、克林霉素、利福平、 泰能、万古霉素等敏感，抗生素能抑制或杀灭微生物活菌，拮抗其作用。张宏梅等（张 宏梅，黄绍松，周汉基等.酸奶中乳酸菌对2种抗生素耐药性分析[J].中国公共卫 生.2010, 26(4) :511-512)，从四种酸奶中分离出的7株乳酸菌的基因组中有5株含抗氨 苄青霉素的抗性基因 Amp。张灼阳等（张灼阳，刘畅.乳酸菌耐药性的研究进展[J].中 国微生态学杂志，2007,19 (5) :478-480)对几种主要乳酸菌的耐药表型进行总结研究后 发现：大部分乳酸菌对抗革兰阴性菌的抗菌药具有耐药性，例如链霉素、庆大霉素和卡 那霉素（kanamycin);乳杆菌属中的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌 (L.salivarius)和李氏曼乳杆菌（L. Ieishmanii)都对万古霉素（vancomycin)具有耐药 性。石晶红等（石晶红，李少英.双歧杆菌对9种抗菌素的敏感性[J].内蒙古农业大学学 报（自然科学版），2005, 26 (4) :143-145.)对动物（奶牛）源性双歧杆菌的药敏实验中也 得到同样的结论，发现从乳犊牛分离出的不同菌株均对甲硝唑和氨基糖苷类抗菌药表现出 较强的耐药性，对β-内酰胺类抗菌药中的头孢氨苄有一定的耐性，而对氨苄西林表现出 不同的敏感性。
[0008] 近十年来，国外在益生菌的耐药性方面做了大量研究工作。D'AIMMO等较系统 地报道了双歧杆菌、乳杆菌、片球菌等对卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素 B等的抗性以及与 抗性有关的基因，如Bifidobacterium Iongum抗四环素（tetracycline)的基因 tetW， 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei)抗四环素和红霉素（erythromycin)的质粒基因 tetM 和 ermB 等（D'AIMMOMR，M0DEST0M，BIAVATI B. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp.Isolated from dairy and pharmaceutical products. International Journal of Food Microbiology,2007, 115 (I):35-42)〇T00MEYN 等则进一步研究报道了戊糖乳杆菌（Lactobacillus plantarum)的抗四环素基因 tetM在 菌株间的转移（Τ00ΜΕΥ N，B0LT0ND, FANNINGS. Characterisation and Transferability of antibiotic resistance genes from lactic acid bacteria isolated from Irish pork and beef abattoirs. Researchin Microbiology, 2010, 161 (2):127-135)〇 Liviaq F等通过对Bacteroides fragilis的研究得到cfxA基因对头孢菌素以及β -内酰胺类的 的抗生素抗性起作用（Liviaq F, Katia ESA, Jessica MBD, et al. Association Between the CfxA Gene and Transposon Tn4555in Bacteroides distasonis Strains and Other Bacteroides Species. Current Microbiology. 2007, 54:348-353)。通过研究两株 Staphylococcus aureus，得到庆大霉素抗性基因 mecA、femA。这种抗药基因在菌种间的转 移对于人类将是很大的威胁。
[0009] 乳酸菌在自然界分布广泛，且作为益生菌广泛应用于食品、饲料和医药卫生等相 关领域。近年来，越来越多的研究表明，抗生素的广泛应用在治疗疾病的同时，也使得环境 中耐药菌株的种类及数目增加。目前，人类对抗生素抗性的研究大多集中在致病菌上，对乳 酸菌的抗生素抗性及抗性基因是否能够水平转移缺少系统性的研究，随着益生乳酸菌的普 及和广泛应用，人们对益生菌的研究越来越深入对于乳酸菌的抗生素抗性越来越关注。
【发明内容】
[0010] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株具有氨苄青霉 素抗性的长双歧杆菌（Bifidobacterium Iongum) 〇
[0011] 本发明的另一目的在于提供一株具有氨苄青霉素抗性的嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)〇
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种用于治疗肠道疾病的制剂。
[0013] 本发明的再一目的在于提供上述菌株以及制剂的应用。
[0014] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一株具有氨苄青霉素抗性的长双歧杆菌 (Bifidobacterium Iongum)，名称为长双歧杆菌（Bifidobacterium longum)HB25,于 2014 年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO :M 2014235 ;
[0015] 所述的长双歧杆菌的培养条件为将斜面长双歧杆菌菌种接种至乳酸菌MRS增菌 肉汤培养基中，PH6. 2~6. 4,培养温度为37°C，150~250rpm厌氧振荡培养36~60h，即 完成长双歧杆菌的扩增；
[0016] -株具有氨节青霉素抗性的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)，名称为 嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)HL9,于2014年5月23日保藏于中国典型培养 物保藏中心（CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO :M 2014234 ;
[0017] 所述的嗜酸乳杆菌的培养条件为将斜面嗜酸乳杆菌菌种接种至乳酸菌MRS增菌 肉汤培养基中，PH6. 2~6. 4,培养温度为37°C，150~250rpm厌氧振荡培养36~60h，即 完成嗜酸乳杆菌的扩增；
[0018] -种用于治疗肠道疾病的制剂，包括上述具有氨苄青霉素抗性的长双歧杆菌HB25 和/或嗜酸乳杆菌HL9 ;
[0019] 更优选地，还可以包括动物双歧杆菌BB-12 (Bifidobacterium animalis BB-12)、鼠李糖乳杆菌 LGG(Lactobacillus rhamnosus GG)、嗜热链球 菌 ATCC 14485(Streptococcus thermophiIus AT