，工艺简单，产品纯度高；
[0033] (3)采用膜分离、纳滤脱色、膜浓缩等先进处理工艺节省了能耗，节省了活性炭的 用量，减少了对环境的污染，降低了生产成本，提高了产品质量。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0035] 实施例1 一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株MQ0-153,本发明通过对粪链球菌（粪 链球菌购自北京微生物菌种保藏中心）多次的化学诱变、紫外诱变，以及经过大量的菌种 筛选获得了一株产得的精氨酸脱亚氨基酶活性高的菌株MQ0-153,其保藏编号为CGMCC No. 10726 ;保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2015 年4月21 ;保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0036] 实施例2利用菌株MQ0-153制备精氨酸脱亚胺酶的方法，具体步骤如下：
[0037] (1)斜面培养：将菌株MQ0-153在无菌条件下接种到斜面培养基上进行培养，培养 温度为30°C，培养时间为24h，此时，菌落大而光滑，无色素积累；
[0038] 斜面培养基：斜面培养基（g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,氯化钠5,琼脂20 ;pH为 7. 0-7. 3 ;优选为7. 2 ;斜面培养基的灭菌温度115°C，灭菌时间15min。
[0039] (2)扩大培养：从步骤（1)的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，稀 释后的浓度为3 X 105-5 X IO5个/mL，将菌体溶液接种到种子培养基上置于摇床中进行扩大 培养，接种量为10% (v/v)，扩大培养的温度为30°C，培养时间为18h，摇床振幅为85mm，摇 床频率为〇-18h，摇床转速为100r/min。
[0040] 种子培养基（g/L):葡萄糖30,牛肉膏5,蛋白胨10,氯化钠15,磷酸二氢钾3,硫酸 镁0. 5,硫酸亚铁0. 05,硫酸锰0. 05, VB1 · HCl 0. 005 ;用氢氧化钠调节pH为7. 0 ;250mL三 角瓶装液量为20mL，1000 mL三角瓶装液量为150mL ;种子培养基灭菌温度为115°C，灭菌时 间为15min。
[0041] (3)发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10% (v/ v)，接种时菌体溶液的浓度为3 X 105-5 X IO5个/mL，培养条件为：培养温度35°C，培养时间 28 小时，摇床振幅 85mm，0-10h，摇床转速 100r/min，10-20h，摇床转速 120r/min，20-28h，摇 床转速100r/min ;
[0042] 发酵培养基（g/L):葡萄糖3,酵母膏10,牛肉膏5,蛋白胨10,玉米浆5,酵母膏 1，氯化钠5,磷酸二氢钾3,硫酸镁0. 5, L-精氨酸5,硫酸亚铁0. 05,硫酸锰0. 05, VB1HCl 0. 005 ;用氢氧化钠调节pH为7. 2,灭菌温度121°C，灭菌时间20min。
[0043] (4)30L发酵罐培养：将步骤（3)中发酵培养后的发酵液接种到30L发酵罐的 培养基中，接种量为10% (v/v)，控制罐压0. 05MPa，在35°C条件下培养24小时，搅拌转 速600-800rpm，风量I :0. 8m3/m3. min(vvm)，控制溶氧30-40%，全程用无菌饱和氨水控制 pH6. 7-7. 0,中途补糖控制残糖为1%，放罐残糖为0%，发酵后得精氨酸脱亚胺酶菌体。
[0044] 实施例3 L-精氨酸精经过精氨酸脱亚胺酶的转化制备L-瓜氨酸的方法，具体步 骤如下：
[0045] (1)底物的获得：将精氨酸陶瓷膜过滤液经732氨型树脂吸附，用2. ON氨水洗脱， 得到精氨酸阳柱纯化液；
[0046] (2)转化培养：将含有精氨酸脱亚胺酶的菌体，用生理盐水洗涤1次，离心后收 集菌体。将菌体转移到转化液中，转化液包括0. 45mol/L的醋酸缓冲液和0. 5g/L的CTAB， 加入10%的L-精氨酸纯化液，37°C保温24h，即得L-瓜氨酸转化液。
[0047] 实施例4 L-瓜氨酸转化液的分离纯化
[0048] (1)离子交换：将转化液经氨型732树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用 1.0 N氨水洗脱，洗脱液再过流D335-OH型树脂除去阴离子杂质得到鸟氨酸纯化液，收率达 到 95% ;
[0049] (2)纳滤：采用600-800分子量纳滤膜过滤鸟氨酸纯化液得到瓜氨酸纳滤清液，用 3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含瓜氨酸产品的纳滤透 析液，该步骤收率达到98% ;
[0050] (3)调pH、脱色：用盐酸调节瓜氨酸纳滤清液的pH至4. 5,用活性炭进行脱色，活 性炭的用量为瓜氨酸纳滤清液的〇. 5% (质量分数），脱色温度为50°C，脱色时间为30min， 用0. 22 μ m滤膜过滤得脱色液，脱色液透光率多99 %，收率达到99 % ;
[0051] (4)反渗透浓缩：将瓜氨酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到瓜氨酸脱氨 后的预浓缩液，收率达到99% ;
[0052] (5)浓缩结晶：将预浓缩液在真空度多0. 095,蒸发温度50°C条件下浓缩至浓缩度 含量多80%的浓缩液，将浓缩液放至5°C冰箱保温2h得到瓜氨酸结晶。
[0053] 试验例1本发明中转化条件的确定
[0054] (1)反应温度的确定反应温度对L-瓜氨酸产量的影响，在25°C -42°C范围内的不 同温度下，固定化细胞和游离细胞的转化反应IOh的情况，温度越高瓜氨酸产率越高，37°C 达到最高，超过37°C则产率下降。
[0055] (2)pH的确定pH对L-瓜氨酸产量的影响，配制不同pH条件下的底物溶液（pH4. 0、 5. 0、8. 0)，在37°C下反应10h，考察pH对酶活（产物量）的影响，pH为6. 5时底物浓度最 尚，即相对酶活最尚。
[0056] (3)转速的确定转速对L-瓜氨酸产量的影响，当转速为120r/min时瓜氨酸产量最 大。但是转速对颗粒的强度造成很大的影响，故采用转速为l〇〇r/min。
[0057] (4)底物浓度和反应时间的确定底物浓度和反应时间对L-瓜氨酸产量的影响，随 着L-精氨酸浓度的增大，L-瓜氨酸浓度达到最大所需要的时间逐渐延长。当L-精氨酸浓 度为10%时，固定化细胞转化20h瓜氨酸浓度达到最大，延长时间产物浓度不再增加而趋 于稳定；当L-精氨酸浓度继续增加时，产物L-瓜氨酸的产量不再增加而趋于稳定，此时增 加底物浓度已没有意义，故而选择底物L-精氨酸浓度为10%。
[0058] 试验例2精氨酸摩尔转化率的测定
[0059] 将菌体接种到50mL液体培养基中于30°C培养24h。培养好的发酵液4°C下4000r/ min离心30min，弃去上清液。将菌体转移至IOmL醋酸缓冲液，加入0. 15g精氨酸，在37°C 下转化24h。6000r/min离心10min，测定上清液中的L-瓜氨酸浓度，并计算底物精氨酸的 摩尔转化率y，以此表示精氨酸酶的活力。本发明测得精氨酸摩尔转化率为98. 2%。
[0060] y = nA/nB
[0061] 其中nA为转化液中L-瓜氨酸的物质的量（mol) ;nB为转化液中原始的精氨酸的 物质的量（mol)。
[0062] 试验例3本发明中获得的L-瓜氨酸盐酸盐的检验
[0063] 中试产品经青岛谱尼测试有限公司的第三方检验，各项指标符合美国联邦通讯委 员会，L-瓜氨酸盐酸盐USP标准，主要性能指标见表1所示：
[0064] 表 1
【主权项】
1. 一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株MQ0-153,其特征在于，所述菌株MQ0-153的保藏编号 为CGMCCNo. 10726 ;保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日 期为2015年4月21 ;保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2. 如权利要求1所述的菌株MQ0-153在制备精氨酸脱亚胺酶方面的应用。3. 如权利要求1所述的菌株MQ0-153,其特征在于，所述菌株MQ0-153与可接受的载体 组成的组合物在制备精氨酸脱亚胺酶方面的应用。4. 根据权利要求1所述的菌株MQ0-153,其特征在于，培养所述菌株MQ0-153的斜面培 养基（g/L)为： 牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g,纯水定容到1L。5. 根据权利要求4所述的菌株MQ0-153,其特征在于，所述斜面培养基的pH为 7. 0-7. 3〇6. 根据权利要求5所述的菌株MQ0-153,其特征在于，所述斜面培养基的pH为7. 2。7. 根据权利要求4所述的菌株MQ0-153,其特征在于，所述斜面培养基的灭菌条件为 115。。灭菌 15min〇8. 根据权利要求1所述的菌株MQ0-153,其特征在于，所述菌株MQ0-153在斜面培养基 上培养温度为30°C，培养时间为24h。
【专利摘要】本发明涉及一株产精氨酸脱亚胺酶的菌株MQO-153，所述菌株MQO-153的保藏编号为CGMCC？No.10726；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为2015年4月21；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明中菌株MQO-153可发酵制备用于酶转化法生产L-瓜氨酸的精氨酸脱亚胺酶。CGMCC No.1072620150421
【IPC分类】C12N9/78, C12N1/20, C12R1/46, C12P13/10
【公开号】CN105176859
【申请号】
【发明人】高法民, 高树营, 李令娣
【申请人】山东民强生物科技股份有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年7月1日