一种延缓蔬果成熟的微生物菌剂及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法，尤其涉及一种可用于延长蔬果保鲜时 长的微生物菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在水果运输、储藏、加工、销售以及食用前延迟其成熟时间，直接关系到果实的内 在品质和经济收益。目前，市面上常见的水果保鲜技术包括应用银盐，高锰酸钾，1-甲基环 丙烯，环丙稀等以及这些化合物的类似物，这些方法涉及重金属以及难闻的化学味道。另 外，其它水果保鲜技术还包括水果表面打食用蜡；包裹保鲜膜；低温储存，气体封闭等。然 而，这些方法存在较多的局限性，如：水果表面喷施的食用蜡不易清除，且过多摄入食用蜡 会对人体产生不良影响；低温保存对水果储存设施要求较高，且耗能较大，同时不能应用于 一些不宜冷藏的水果（如：香蕉）；表面包裹保鲜膜增加了水果储藏成本，同时会制造白色 污染，不利环保。目前，利用微生物方法来抑制蔬果成熟的专利仍较少报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于延缓蔬果成熟的微生物菌剂 及其制备方法，使用经过诱导培养的多种微生物，组成复合菌剂，以非直接接触的方式来 延迟蔬菜和水果的成熟，从而增加保藏时间。
[0004] 本发明是用数个微生物菌种组成的复合菌剂，与水果表面非直接接触后，延迟 其成熟的时间，所涉及到的微生物包括：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，红球菌属 (Xanthophyllomyces)，红曲霉菌（Monascus purpureus)，戈登氏菌属（Gordonia)，酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)和瘦果红酵母（Rhodotorula acheniorum)。上述细菌均可 从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)采购获得。本发明所述的以上 任何单一菌种诱导培养或由任意以上两种或两种以上诱导培养后的菌种混合制成菌剂，用 于延迟蔬果的成熟，该菌剂的制备方法具体包括以下步骤：
[0005] 1)基础培养：将枯草芽孢杆菌、红球菌属、红曲霉菌、戈登氏菌属、酵母菌和瘦果 红酵母接种至各自的基础培养基中（包括nutrient broth，Sabouraud dextrose broth， tryptic soy broth等），在30°摇床上培养1-4天；
[0006] 2)诱导培养：分别制备各细菌相应的诱导培养基-1，是在各细菌原有的基础培 养基的成分里加入以下几种物质：〇. I-IOOmM Zn2+, 0.1 -IOOmM Ni2+，5-280mM维生素 C， 2-35mM维生素 E (可优选采用维生素 E307 ( a -Tocophero 1) )，0. 006-0. 7mM乙酰胆碱和 0. 005-0. 45mM η-乙酰氨基葡萄糖；将步骤1)培养的各细菌离心收集并分别转入相应的诱 导培养基-I中，在30°摇床培养3-5天；
[0007] 再分别制备各细菌的诱导培养基-II，是在各细菌原有的基础培养基的成分里加 入以下几种物质：〇· I-IOOmM Fe2+或 Fe 3+，I-IOOmM Ca2+, I-IOOmM Mg2+和 0· 05-1Μ 羟基脲； 将经上述诱导培养基-I培养的各种细菌离心收集并分别转入相应的诱导培养基-II中，在 30°摇床培养5天以上；
[0008] 3)分别离心收集经步骤2)培养的各种菌体细胞，取枯草芽孢杆菌、红球菌属、红 曲霉菌、戈登氏菌属、酵母菌和瘦果红酵母中的一种或几种的混合，获得微生物菌剂。
[0009] 上述技术方案中，将各细菌在基础培养基、诱导培养基-I或诱导培养基-II中 培养时，通常培养至使枯草芽孢杆菌，戈登氏菌属和瘦果红酵母各自的菌液终浓度达到 10sCFU/mL(每毫升中菌落形成单位个数）以上，红球菌属和酵母菌各自的菌液终浓度都达 到 IO7CFUAiL以上，红曲霉菌的菌液浓度在分光光度计600纳米处的吸光值达到2. 5以上。 [0010] 优选的，步骤3)中取步骤2)诱导培养后的瘦果红酵母、枯草芽孢杆菌、红球菌属、 红曲霉菌、戈登氏菌属和酵母菌按质量比1: (0-5) : (0-5) : (0-10) : (0-10) : (0-10)混合的 混合物作为微生物菌剂。
[0011] 本发明制备的微生物菌剂可用于延缓蔬菜或水果的成熟。
[0012] 本发明的技术方案中所用到的培养基可以是液体培养基或固态培养基（琼脂培 养基），也可以适用于发酵罐发酵培养。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明是利用微生物方法延迟蔬果成熟的技术，可以以非 直接接触的方式有效延缓香蕉、苹果、牛油果、西红柿等常见蔬果的成熟时间，使用本方法 制备的菌剂成本低廉，且环境友好，无毒无害，绿色安全，可以减少传统保鲜食用蜡和塑料 薄膜的使用。
【附图说明】
[0014] 图1是实施例1的实验结果对照图；
[0015] 图2是实施例2的实验结果对照图；
[0016] 图3是实施例3的实验结果对照图。
【具体实施方式】
[0017] 本发明的延缓蔬果成熟的微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
[0018] 步骤一、从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)采购以下菌 种：枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)，编号：1.4255 ;红球菌属（Xanthophyllomyces)， (Xanthophyllomyces dendrorhous，编号：2· 1557);红曲霉菌（Monascus purpureus)，编 号：3. 5839 ;西洼湖戈登氏菌（Gordonia sihwensis)编号：4. 2184 ;沟戈登氏菌（Gordonia amarae)编号：4· 1126 ;酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)编号：2· 3973 ;瘦果红酵母 (Rhodotorula acheniorum)编号：2. 4248。根据各种菌种的具体要求，将上述菌种接种至各 自的液体培养基（包括 nutrient broth，Sabouraud dextrose broth, tryptic soy broth 等）中，在30 °摇床（转速100-200rpm)上培养1-4天；
[0019] 步骤二、将上述各细菌，分别转入诱导培养基-I中，在30°摇床（转速 100-200rpm)培养3-5天。诱导培养基-I是在原有的基础培养基的成分里加入以下几种物 质：0· I-IOOmM ZnCl2,0.1 -IOOmM NiCl2, 5-280mM维生素 C，2-35mM维生素 E，0.006-0. 7mM 乙 酰胆碱和0.005-0. 45mM η-乙酰氨基葡萄糖。然后将细菌收集并转入诱导培养基-II中， 在30°摇床（转速100-200rpm)培养5天以上。诱导培养基-II是在原有的基础培养基 的成分里加入以下几种物质：〇. I-IOOmM FeCl2SFeCl3, I-IOOmM CaCl2, I-IOOmM MgCl2，和 0. 05-1M羟基脲；
[0020] 步骤三、8000g高速离心收集诱导培养基中的各种菌体细胞，按一定比例混合制成 菌剂。将不同质量的菌剂放入一个空的培养皿，以清水为对照，将该培养皿和待测水果一同 放入一个封口的塑料容器中（不必气密），进行蔬果的成熟转变试验。
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0022] 实施例1 :
[0023] 分别在基础培养基中培养枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)和瘦果红酵母 (Rhodotorula acheniorum) 1-4 天。使 Bacillus subtilis 和 Rhodotorula acheniorum 菌 液的终浓度都达到10sCFU/mL以上。离心并收集上述细菌的沉淀，并转入诱导培养基-I培 养3天，该诱导培养-I基包含0. 4mM ZnCl2, 3. 8mM NiCl2,85mM维生素 C，34. 8mM维生素 E， 0. 068mM乙酰胆碱和0. 23mM η-乙酰氨基葡糖。再转入诱导培养基-II培养5天，该诱导培 养-Π 含有 5mM FeCl2SFeCl3, ImM CaCl2, ImM MgCl2，和 260mM 羟基脲。8000g 高速离心收 集诱导培养基中的菌体细胞，按照菌体质量比=1:1的比例混合，制成菌剂，如图1所示，在 培养皿中放置5g细菌菌剂，以清水为对照，将未成熟的香蕉和培养皿一同放置在一个4. 4L 的塑料盒子里，盖上盖子，分别在不同的时间点（〇天，6天，16天）观察和拍照，记录水果成 熟情况。
[0024] 本例中以香蕉表面褐变程度作为评判标准，将结果记录于表1表示基本没有 变化；" + "表示褐变程度较轻；"++"表示褐变程度相对较重。
[0025] 表 1
[0027] 实施例2 :
[0028] 在基础培养基（包括 nutrient broth，Sabouraud dextrose broth，tryptic soy broth，等）中培养瘦果红酵母（Rhodotorula acheniorum)，枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)，红球菌（Xanthophyllomyces dendrorhous)，沟戈登氏菌（Gordonia amarae)， 酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)等种属的细菌 1-4 天。使 Bacillus subtilis 和 Gordonia amarae 菌液的终浓度达到 108CFU/mL 以上，Xanthophyllomyces dendrorhous 和 Saccharomyces cerevisiae 菌液的终浓度达到 107CFU/mL 以上，Monascus purpureus 的浓 度达到0D600到2. 5以上。并转入诱导培养基-I培养3天，该诱导培养基-I包含0. 6mM ZnCl2, 2. 3mM NiCl2,96mM 维生素 C，12mM 维生素 E，0. 068mM 乙酰胆碱和 0. 23mM η-乙酰氨 基葡糖。再转入诱导培养基-Π 培养8天，该诱导培养-II含有ImM FeCl2S FeCl3, ImM CaCl2, ImM MgCl2，和130mM羟基