由麸皮、米糠和乳糖按重量份80: 20: I比例配制而成的培养基30g，并按该固形物重量的I倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(I)种子液各2ml，混合均匀、35?38°C培养24h后，于O?4°C保存，备用；
[0021](3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养:固体发酵培养基为麸皮:米糠:氢氧化钙按重量份90: 10: 2的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min ;，将步骤(2)每瓶三角瓶种子加150?300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子:以固形物重量计的10公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2?3cm后，于35?38°C室温条件下发酵培养20?24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；
[0022](4)凝结芽孢杆菌厌氧固体发酵培养:将经曲盘有氧发酵后的培养物转入密封的塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35?38°C培养条件下继续培养24?36h.至凝结芽孢杆菌芽孢率达到80%以上时，停止发酵；在不高于50°C条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
[0023]结果是:通过本发明的实施例子1，获得90%的凝结芽孢杆菌得以转化，以芽孢的形式存在；芽孢数量为每克干物质98亿个。
[0024]实施例2:(固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法2)
[0025]本例中，步骤⑵凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备:500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份85: 15: 1.5比例配制而成的培养基25g，并按该固形物重量的
1.1倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤⑴种子液各2ml，混合均匀、35?38°C培养24h后，于O?4°C保存，备用；
[0026]步骤(3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养:固体发酵培养基为麸皮:米糠:氢氧化钙按重量份85: 15: 1.5的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min ;，将步骤⑵每瓶三角瓶种子加150?300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子:以固形物重量计的15公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2?3cm后，于35?38°C室温条件下发酵培养20?24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；其余工艺、步骤同实施例1。
[0027]结果是:通过本发明的实施例子1，获得92%的凝结芽孢杆菌得以转化，以芽孢的形式存在；芽孢数量为每克干物质109亿个。
[0028]实施例3:(固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法3)
[0029]本例中，步骤⑵凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备:500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份90: 10: 2比例配制而成的培养基20g，并按该固形物重量的1.2倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(I)种子液各2ml，混合均匀、35?38 °C培养24h后，于O?4°C保存，备用；
[0030]步骤(3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养:固体发酵培养基为麸皮:米糠:氢氧化钙按重量份80: 20: I的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min ;，将步骤⑵每瓶三角瓶种子加150?300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子:以固形物重量计的20公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2?3cm后，于35?38°C室温条件下发酵培养20?24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；
[0031]其余工艺、步骤同实施例1。
[0032]结果是:通过本发明的实施例子1，获得86%的凝结芽孢杆菌得以转化，以芽孢的形式存在；芽孢数量为每克干物质87亿个。
【主权项】
1.一种固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于按以下步骤进行: (1)保藏号为ACCCN0.00403菌株的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的种子液培养:将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入三角瓶培养基中，300ml三角瓶培养基装量为50ml，经35?38°C，180?200rpm摇床培养16?20h后成为三角瓶液体种子，备用；所述三角瓶的种子培养基为:乳糖1.0 %蛋白胨I %牛肉浸膏0.5 %氯化钠0.5 %，调pH为7.0?7.5，121°C 灭菌 15min ； (2)凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备:500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份80?90: 10?20: I?2比例配制而成的培养基20?30g，并按该固形物重量的I?1.2倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(I)种子液各2ml，混合均匀、35?38°C培养24h后，于O?4°C保存，备用； (3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养:固体发酵培养基为麸皮:米糠:氢氧化钙按重量份80?90: 20?10: I?2的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min ;将步骤⑵每瓶三角瓶固体种子加150?300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子:以固形物重量计的10?20公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2?3cm后，于35?38°C室温条件下进行有氧发酵培养20?24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵； (4)凝结芽孢杆菌厌氧固体发酵培养:将经曲盘有氧发酵后的培养物转入密封的塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35?38°C培养条件下培养24?36h ;至凝结芽孢杆菌芽孢率达到80%以上时，停止发酵；在不高于50°C条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
【专利摘要】本发明公开了一种固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法，属于微生物发酵技术领域。方法包括(1)凝结芽孢杆菌的种子液培养；(2)三角瓶固体菌种的制备；(3)凝结芽孢杆菌的有氧固体发酵培养；(4)凝结芽孢杆菌的厌氧固体发酵培养等步骤、工艺。本发明利用凝结芽孢杆菌先有氧发酵后厌氧发酵的工艺，具有凝结芽孢杆菌发酵水平高，芽孢生成率高等特点。本发明可在饲用凝结芽孢杆菌生产及畜禽、水产企业中推广应用。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/07
【公开号】CN105176870
【申请号】
【发明人】孝辉, 邓波, 徐子伟
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月16日