一种基于pcr-rflp鉴定中药材鹿茸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材鉴定领域，涉及一种基于PCR-RFLP鉴定中药材鹿茸的方法，特 别涉及一种基于PCR-RFLP鉴定中药材鹿茸的试剂盒及其鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 药材鹿鸾的基源动物共有两个来源，分别为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生鸾毛的幼角。前者习称"花 鹿茸"，后者习称"马鹿茸"。由于鹿茸属于细贵中药材，价格高昂，目前药材市场上常能见到 鹿茸伪品，质量问题严重。鹿茸的主要伪品包括驯鹿、驼鹿、水鹿、麋鹿、狍子、小麂等未骨化 的茸，其中驯鹿、水鹿、狍子等的茸较为常见。目前人们主要通过传统的性状鉴别方法来区 分鹿茸及其混伪品，但在经过炮制加工后，鹿茸及其混伪品的性状特征消失，差别不明显。 此外，也有研究表明可采用DNA测序技术和位点特异性PCR技术对这两个品系进行鉴别，但 DNA测序技术鉴别结果不够直观，操作略显复杂。而使用位点特异性PCR技术一般需对梅 花鹿和马鹿分别设计一对引物，一般只用于鉴别鹿茸和其他科物种如牛、牦牛、羊等或远缘 鹿科动物麋鹿或驯鹿，无法同时鉴别梅花鹿和马鹿。另一方面，DNA测序技术和位点特异性 PCR技术只能检测待测样品是否含有正品鹿茸（梅花鹿或马鹿），无法判断是否是正品鹿茸 还是正品鹿茸和混伪品的混合样品。
[0003] 市场流通的商品鹿茸经由炮制加工、运输储藏后，甚至切片分类后，形态有所改 变，难以区分。因此，急需建立科学性强、使用方便的，同时具有共显性特点，能同时检测正 品、伪品、正伪混合样品的鹿茸鉴别方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定中药鹿茸的试剂盒。
[0005] 本发明所提供的用于鉴定中药鹿茸的试剂盒，具体含有如下（a)或（b)所示的引 物对，以及限制性内切酶DdeI或其同裂酶；
[0006] (a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
[0007] (b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与（a)中所述引物对功能相同的引 物对。
[0008] 其中，序列1由27个核苷酸组成，序列2由20个核苷酸组成。
[0009] 所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定中药鹿茸中的应用也属于本发明的保护范围。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种基于限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-RFLP)技术鉴定或辅助鉴定待测中药为鹿茸正品、鹿茸伪品还是鹿茸正伪混合样品的 方法。
[0011] 本发明所提供的基于PCR-RFLP技术鉴定或辅助鉴定待测中药为鹿茸正品、鹿茸 伪品还是鹿茸正伪混合样品的方法，具体可包括如下步骤：
[0012] (1)从待测中药中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对（序列1和序列2) 进行PCR扩增；
[0013] (2)采用限制性内切酶DdeI对步骤（1)所得PCR产物进行完全酶切；
[0014] (3)按照如下方法确定所述待测中药为鹿茸正品、鹿茸伪品还是鹿茸正伪混合样 品：若经步骤（2)酶切获得的DNA片段为如下（al)，则所述待测中药为或候选为鹿茸正品； 若经步骤（2)酶切获得的DNA片段为如下（a2)，则所述待测中药为或候选为鹿茸伪品；若 经步骤（2)酶切获得的DNA片段为如下（a3)，则所述待测中药为或候选为鹿茸正伪混合样 品：
[0015] (al)大小分别为103bp和160bp的两个DNA片段；
[0016] (a2)大小为263bp的单一 DNA片段；
[0017] (a3)大小为 103bp、160bp 和 263bp 的三个 DNA 片段。
[0018] 进一步，所述步骤（3)中，大小为103bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中 序列3的第1-103位，大小为160bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列3的第 104-263位，大小为263bp的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表中序列4。
[0019] 在实际应用中，判断酶切产物中是否含有目的DNA片段时，可通过将酶切产物进 行琼脂糖凝胶电泳，看电泳图谱上是否含有目的条带：电泳图谱上含有目的条带，则酶切产 物中含有相应的目的DNA片段。
[0020] 在实际应用中，判断酶切产物中是否含有序列3的第1-103位、序列3的第 104-263位或序列4所示DNA片段，可通过对酶切产物进行核苷酸序列测定来判断。
[0021] 在所述方法的步骤（1)中，进行所述PCR扩增时，组成所述引物对的两条引物在反 应体系中终浓度均为200nmol/L。
[0022] 在本发明的一个实施例中，进行所述PCR扩增时，所述反应体系具体为：10 X PCR 缓冲液 2. 5 μ L、dNTP (2. 5mmol · L 3 1. 5 μ L、Taq DNA 聚合酶（5U · L 3 0· 4 μ L 和模板 DNA 1 μ L (30ng)，上下游鉴别引物（10 μ mol · L 3各0. 5 μ L，灭菌蒸馏水补足至25 μ L。
[0023] 在所述方法的步骤（1)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度可为50_60°C (如 56〇C ) 〇
[0024] 在本发明的一个实施例中，进行所述PCR扩增时的反应程序具体为：95°C预变性 5min，热循环反应 35 次（95°C 30s，56°C 30s，72°C 30s)，72°C延伸 5min ;反应结束后 4°C保 存。
[0025] 在所述方法的步骤（2)中，所述完全酶切是指限制性内切酶Dde I的用量相对于 步骤（1)所得PCR产物而言是过量了，足以切割所有能够被切割的所述PCR产物。采用限 制性内切酶Dde I对步骤（1)所得PCR产物进行酶切时，酶切体系具体可为：限制性内切酶 Dde I 的 buffer 2. 0 μ 1，限制性内切酶 Dde I 0· 5 μ I (5U)，PCR 产物 17. 5 μ 1。
[0026] 在本发明的一个实施例中，所述限制性内切酶Dde I及其buffer均为NEB公司产 品，其产品目录号为#R〇175L。
[0027] 在所述方法的步骤（2)中，采用限制性内切酶Dde I对步骤（1)所得PCR产物进 行酶切时，酶切反应条件具体可为37°C孵育lh。
[0028] 本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定中药鹿茸的引物对。
[0029] 本发明所提供的用于鉴定中药鹿茸的引物对，具体为下（a)或（b)所示的引物 对：
[0030] (a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
[0031] (b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与（a)中所述引物对功能相同的引 物对。
[0032] 所述引物对在鉴定或辅助鉴定中药鹿茸中的应用也属于本发明的保护范围。
[0033] 本发明的第四个目的是提供一种基于PCR技术鉴定或辅助鉴定待测中药为鹿茸 正品、鹿茸伪品还是鹿茸正伪混合样品的方法。
[0034] 本发明所提供的基于PCR技术鉴定或辅助鉴定待测中药为鹿茸正品、鹿茸伪品还 是鹿茸正伪混合样品的方法，具体可包括如下步骤：
[0035] (1)从待测中药中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对（序列1和序列2) 进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0036] (2)按照如下方法确定所述待测中药为鹿茸正品、鹿茸伪品还是鹿茸正伪混合样 品：若所述PCR产物为如下（bl)，则所述待测中药为或候选为鹿茸正品；若所述PCR产物为 如下（b2)，则所述待测中药为或候选为鹿茸伪品；若所述PCR产物为如下（b3)，则所述待测 中药为或候选为鹿茸正伪混合样品：
[0037] (bl)单一 PCR产物：核苷酸序列为序列表中序列3所示的DNA片段；