一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的 萜类合成酶基因启动子（pr〇TPS7)及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 青蒿（Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发 性香气，从青蒿腺毛中提取的青蒿精油含有大量具有药理学或者生物灭杀活性的萜类化 合物和黄酮类化合物。青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛（glandular secretory trichome，GST)和非分泌型腺毛（T shape trichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发 育、防御和花粉传播等都起到至关重要的作用。青蒿素（Artemisinin)是从其地上部分分 离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前抗疟药中效果最好、毒性最低的 药物。青蒿素联合疗法（Artemisinin-based combination therapies，ACTs)已成为世界 卫生组织推荐的治疗。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而，青蒿中青蒿 素的含量非常低（〇. 01 % -1 % )，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。
[0003] 启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启 动子就像一个"开关"，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功 能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因 工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S)，这种启动 子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且 不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和 危害。
[0004] 因此，本领域的技术人员致力于开发一种在植物的组织器官中特异性表达的启动 子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。
【发明内容】
[0005] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种在植物的组 织器官中特异性表达的启动子，从而在时间和空间上调控目的基因的表达，从而用以深入 研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。
[0006] 本发明的一方面提供了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，该启动子 的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示。该启动子为既是诱导型启动子，又是特异型启动子。 该启动子为萜类合成酶基因启动子。
[0007] 进一步地，该启动子上的顺式作用元件包括：CGTCA-motif、HSE、MBS、MRE、TC-rich repeats、WUN-motif〇
[0008] 本发明的另一方面提供了一种制备上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动 子的方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤一、从青蒿基因组中克隆该启动子的基因组序列；其中，青蒿基因组从培养的 青蒿无菌苗中获得；
[0010] 步骤二、分析该启动子上的顺式作用元件，确定该启动子类型；
[0011] 步骤三、将步骤一中获得的该启动子的序列与载体连接；
[0012] 步骤四、将步骤三中获得的载体转化根癌农杆菌；
[0013] 步骤五、将步骤四中获得的带有上述载体的根癌农杆菌稳定转化植物；该植株为 青蒿；
[0014] 步骤六、检测上述启动子的转入，并确定上述启动子所引导的基因在植株中的表 达部位；检测启动子转入的方法为PCR检测，启动子引导的基因为GUS报告基因。
[0015] 进一步地，上述制备方法中，步骤一包括以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR 方法扩增所述启动子序列；其中，巢式PCR的引物为：
[0017] 进一步地，上述制备方法中，步骤三中的载体为pCAMBIA1391z，利用引物对 1391z-proTPS7-F和1391z-proTPS7-R，通过PCR在获得的启动子序列中引入酶切位点PstI 和Ncol，从而连接到载体pCAMBIA1391z上，其中引物序列如下所示：1391z-proTPS7-F : 5' -AACTGCAGAAGAGAAAGCTACATACAATGGGAA-3' ；1391z-proTPS7-R :5' -CATGCCATGGGGAGAAAG ATCGGTTATGC-3'。
[0018] 进一步地，上述制备方法中，步骤五包括：1)外植体的预培养；2)农杆菌与外植体 的共培养；3)抗性再生植株的筛选。
[0019] 本发明还提供了一种载体，该载体连接有上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的 启动子。
[0020] 本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括上述调控基因在非分泌型腺毛中表达 的启动子。
[0021] 本发明还提供了上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子用于利用植物腺 毛组织表达和在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
[0022] 本发明还提供了上述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在非分泌型腺 毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控研究中的应用。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于腺毛特异表达的启动子对于植物的 腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种 弊端。因此，克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子对于青蒿素代谢工程具有十分重要的 意义。本发明利用有效的青蒿表皮腺毛组织特异性启动子代替组成型启动子，构建在分子 生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入 其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作以获得转基因植物，并且不会对植物 的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种 中。
[0024] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0025] 图1是本发明的一个较佳实施例的转基因青蒿植株的PCR阳性检测。其中，M :分 子量标记；1-2泳道：以转基因阴性青蒿植株的基因组DNA为模板的PCR产物；3-7 :以转基 因青蒿植株基因组DNA为模板的PCR产物；+ :阳性对照；-:阴性对照。
[0026] 图2是本发明的一个较佳实施例的利用AaTPS7基因启动子与⑶S基因融合的载 体pCAMBIA1391z-pr〇TPS7通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中⑶S组 织染色图。
【具体实施方式】
[0027] 下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人的《分子克隆：实验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年 版）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0028] 本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄； 根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008, 28(3) :38-43》文 献中公开。根癌农杆菌EHA105和质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如 可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。
[0029] 实施例1
[0030] 从青蒿基因组中克隆启动子的基因组序列
[0031] 1、培养青蒿无菌苗：
[0032] 青蒿种子用体积分数为75 %的乙醇浸泡lmin，再用20 % (w/v)的NaClO浸泡 20min后，无菌水冲洗3次~4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培 养基上，25°C、16h/8h (日光/黑夜）光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
[0033] 2、基因组DNA的提取
[0034] 在I. 5mL离心管中放一片青蒿叶片（Icm2左右大小，用冰盒盛取），加入2粒钢珠。 加入300 yL TPS buffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇），55-60Hz，震荡100秒。 再加入300 μ L TPS buffer (通风橱）。65°C水浴Ih (每隔20min摇一摇），可适当延长时 间，最长1.5h。冷却至室温，4°C 10000rpm离心15min。取300 yL-400 yL上清液。加入 300 μ L-400 μ L异丙醇（异丙醇在-20°C预冷）。混合后在-20°C冰箱中放置10_15min (可 延长至Ih)。取出4°C离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置l〇-15min。加入75%乙醇 500-600 μ L，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体， 放在37°C中烘干，直到沉淀变为透明。加入50 μ L CldH2O回溶，即获得基因组DNA，于4°C保 存。
[0035] 3、PCR 扩增
[0036] 以上述基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。为 了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据基因组测序得到的AaTPS7基因的启动 子序列设计巢式PCR引物如表1所示，第一轮PCR反应体系如表2所示。PCR条件为：94°C 预变性3min ;94°C变性30s ;48°C退火30s ;72°C延伸2min，35个循环；72°C延伸lOmin。在 I %的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。
[0037] 表1巢式PCR引物
[0042] 将第一轮PCR后的产物稀释50倍，作为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR反应体系 见表 3。PCR 条件为：94°C预变性 3min ;94°C变性 30s ;54°C退火 30s ;72°C延伸 lmin20s，35 个循环；72°C延伸lOmin。在I %的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，切胶回收