一种药用野生稻基因OobZIP2及其表达载体和构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水稻基因工程领域，具体涉及一种药用野生稻基因0〇bZIP2及其表达 载体和构建方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的第一大粮食作物。非生物胁迫 如干旱等会严重影响水稻的生长发育及产量。
[0003] 在稻属（Oryza)中，仅有亚洲栽培稻（0· sativa L.)和非洲栽培稻（0· glaberrima Steud) 2个为栽培种，其余20余种均为野生稻，由于长期在野生状态下生长，经过抵御病虫 害的侵袭和不良环境的自然选择，野生稻蕴含了大量的优良基因，是一个天然的基因宝库 (鄂志国等，遗传，2008 (11) :1397-1405.，2008)。但因其与栽培稻（AA染色体组）之间存在 严重的生殖障碍，其有利性状目前未得以高效利用。
[0004] bZIP(Basic Leucin zipper)转录因子即碱性亮氨酸拉链蛋白，它广泛存在于动 物、植物、微生物当中，是一类结构较为保守的转录调控因子。目前，水稻bZIP转录因子家 族成员中，有 0〇ABI5(Zou et al.，2008)、0sbZIP23(Xiang et al.，2008)、0sbZIP72(Lu et al·，2009)、0〇ABF1(Hossain et al·，2010)、0oABF2(Hossain et al·，2010)、0sbZIP60(喻 旭等，2011)、0sbZIP46 (Tang et al·，2012)、0sbZIP39 (Takahashi et al·，2012)、 0sbZIP52 (Liu et al·，2012)、0sbZIP58 (Wang et al·，2013)、0sbZIP71 (Liu et al·，2014) 等被成功克隆，且对干旱、高盐、高温、低温以及其他生物胁迫表现出良好的抗性。因此，针 对药用野生稻中bZIP转录因子家族基因的研究，以及将有利性状的基因介导入栽培稻，对 获得具有优良性状的栽培稻植株具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与栽培稻具有较高同源 性、能有效提高抗逆性的药用野生稻基因0〇bZIP2。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种药用野生稻基因0obZIP2,该基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 作为优选，上述的药用野生稻基因0obZIP2,通过以下步骤制得：
[0009] 1)提取药用野生稻RNA ;
[0010] 2)合成 cDNA 第一链；
[0011] 3) PCR扩增：以CDNA第一链为模板，采用如SEQ ID No. 2所示的上游引物以及如 SEQ ID No.3所示的下游引物，进行PCR扩增，获得目的基因条带，电泳切胶回收。
[0012] 作为优选，上述药用野生稻基因0obZIP2,所述步骤3)中，采用50 μ L反应体系： 10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 yL;2mM dNTPs 5 yL;25mM MgSO4 3 yL;上游引 物（10 μΜ) I. 5 yL，下游引物（10 μΜ) I. 5 yL ;模板 5 yL ;K0D-Plus-Neo(lU · yL-l) I yL ; ddH20 28 μ L ;其中所述模板为cDNA第一链；
[0013] PCR 反应程序为：94°C预变性 2min ;循环（98°C，10sec ;68°C，lmin)40 次；最后 72°C 延伸 5min。
[0014] 本发明的目的之二在于提供上述药用野生稻基因0obZIP2的表达载体的构建方 法，包括以下步骤：
[0015] a)PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，采用如SEQ ID No. 4的上游引物以及如 SEQ ID No. 5所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；
[0016] b)双酶切：用Sac I和Not I对步骤a)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回 收后得到酶切基因片段；
[0017] (3)连接：用5&(：1和如〖1对质粒？的32&(+)进行双酶切，切胶回收后，与步骤13) 得到的酶切基因片段进行连接，得到重组原核表达载体pet32a-〇obZIP2。
[0018] 本发明的目的之三在于提供上述的药用野生稻基因0obZIP2的另一表达载体的 构建方法，所述表达载体为超表达载体，包括以下步骤：
[0019] a) PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，以如SEQ ID No. 6所示的上游引物和如 SEQ ID No. 7所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；
[0020] b)双酶切：用Nco I和Sam I对步骤b)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回 收后得到酶切基因片段；
[0021] c)连接：用Nco I和Sam I对质粒pGBKT7进行双酶切，切胶回收后，与步骤b)得 到的酶切基因片段进行连接，得到表达载体pGBKT7-〇obZIP2。
[0022] 本发明的目的之四在于提供一种氨基酸序列，该氨基酸由上述的药用野生稻基因 0obZIP2编码，所述氨基酸序列如SEQ ID No. 16所示。
[0023] 本发明的目的之五在于提供上述的药用野生稻基因0obZIP2在增强水稻抗逆性 中的应用。
[0024] 本发明的目的之六在于提供上一种转基因植株的制备方法，由上述表述载体转化 农杆菌感受态细胞，并介导入成熟愈伤组织培养得转基因植株。
[0025] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0026] 1.本发明同时提供了一种药用野生稻基因0obZIP2,是通过药用野生稻RNA扩增 而得；经同源性基因比对，该药用野生稻基因0〇bZIP2具有完整⑶S区，且上调基因表达显 著，进化树分析表明，它们属于bZIP家庭的G亚族；
[0027] 2.本发明提供的药用野生稻基因0obZIP2,经转化重组质粒pGBKT7-〇obZIP2的 酵母菌株，在单缺（SD/-Trp)和三缺（SD/-Trp/-His/-Ade)培养基上均能正常生长且在 β-半乳糖苷酶显色反应中均显示蓝色，而转化空载体PGBKT7的酵母菌株只能在单缺 (SD/-Trp)培养基上生长且β-半乳糖苷酶显色反应中不显色，说明0obZIP2激活了下游报 告基因 Trp、His、Ade和LacZ的表达，具有转录激活活性；
[0028] 3.采用pCAMBIA1301载体构建表达载体，通过根癌农杆菌介导法将其导入水稻品 种日本晴，并获得转基因植株，经qRT-PCR验证，Tl转基因植株中0obZIP2表达量显著增高； 该转基因植株在高盐和20% PEG6000胁迫下均比日本晴长势好，说明0obZIP2提高转基因 植株的抗逆性。
[0029] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0030] 图1为0obZIP2分别在四叶期和抽穗期药用野生稻中的表达模式分析，其中C为 四叶期，d为抽穗期；
[0031] 图2为0obZIP2与栽培稻同源基因氨基酸序列比对情况；
[0032] 图3为重组原核表达载体pet-32a-〇obZIP2PCR检测图，其中M泳道为marker，2 泳道为重组原核表达载体pet-32a_0obZIP2 ;
[0033] 图4为重组原核表达载体pet-32a_0obZIP2酶切图，其中M泳道为marker， 3泳道为酶切后重组原核表达载体pet-32a-〇obZIP2 ;4泳道为未酶切重组质粒 pet-32a-〇obZIP2 ；
[0034] 图5为重组超表达载体pCAMBIA1301-0obZIP2PCR检测图，其中M泳道为marker， 1泳道为阴性对照，15-18泳道为重组超表达载体pCAMBIA1301-0obZIP2 ;
[0035] 图6为重组超表达载体pCAMBIA1301-0obZIP2酶切图，其中M泳道为marker， 4泳道为酶切后重组超表达载体pCAMBIA1301-0obZIP2 ;5泳道为未酶切重组超表达载体 pCAMBIA1301-0obZIP2 ;6 泳道为 0obZIP2 目的基因 CDS ;
[0036] 图7为转0obZIP2基因酵母菌株生长情况及β-半乳糖苷酶活性显色反应；其中， a为SD/-Trp培养基，b为SD/-Trp/-His/-Ade培养基，c为β -半乳糖苷酶活性滤纸显色 反应；培养基试验分区如右下方所示；
[0037] 图8为0obZIP2转基因组织培养过程图；其中，a为诱导继代的愈伤组织；b为选 择情况；c为分化情况；d为转基因苗炼苗情况；
[0038] 图9为0obZIP2转基因植株PCR鉴定情况，其中，M泳道为marker ;11-20泳道为 转0obZIP2基因植株鉴定；
[0039] 图10为0obZIP2在转基因植株中的表达量；其中NIP2表示转化受体日本腈中 0obZIP2同源基因的表达量，b2-8表示转0obZIP2基因的转基因苗中目的基因的表达量；
[0040] 图11为