黄绿蜜环菌发酵液有效部位的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及黄绿蜜环菌技术领域，尤其涉及黄绿蜜环菌发酵液有效部位的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]黄绿蜜环菌UiwiWaria是一种名贵的野生食药用菌，主要生长于海拔3000~4300 m的高山草甸上，在青海、西藏、四川、甘肃等均有分布。黄绿蜜环菌含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿物元素和多种维生素，低脂高蛋白，还含有多种具有显著药理活性的生物活性物质，具有很高的食用价值和医疗保健功效。
[0003]生物机体内的活性氧物质的产生和机体内抗氧化防御机制之间的不平衡导致生物体发生氧化趋势，这种氧化压力通过损伤细胞、组织以及损伤重要的功能参与许多疾病的发生发展，例如动脉硬化、癌症、老年性痴呆以及促进衰老等，所以机体内活性氧物质的产生是引起身体各种疾病发生的根源，例如脂质过氧化物在血液中的浓度增加，造成血管病、肝脏功能异常、白内障等。
[0004]肿瘤是目前严重威胁人们生命安全的重大疾病之一，全世界每年都有大量的病人因罹患肿瘤而死亡。肿瘤患者面临医药费昂贵而疗效不尽人意的尴尬局面，因此开发疗效好、毒副作用小的新型抗肿瘤药物以及能够提高机体抗肿瘤能力的新保健品有着广阔的应用价值。
[0005]随着生活节奏的加快及生活压力的加大，失眠患者越来越多，年龄越大失眠发生率越高。失眠症严重困扰着众多人群的生活和工作，使之夜晚辗转难眠、白天不能集中精力，身体健康受到极大的损害。若长期失眠得不到有有效治疗，会使身体各方面的抵抗力明显下降，还会诱发高血压、糖尿病、胃肠道疾病、肥胖、衰老等病症，甚至导致自杀。
[0006]免疫力是人体识别和排除“异己”的自身防御机制，是保持人体生态平衡的重要基石。免疫力降低会使身体处于亚健康状态，表现出精神萎靡、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍等，从而诱发各种疾病。随着现代人生活和工作节奏的加快，人们对能够提高免疫力的保健品、药品需求越来越大，但现在市场上并没有提供一种有效提高免疫力的保健品。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易于实施的黄绿蜜环菌发酵液有效部位的制备方法。
[0008]本发明所要解决的另一个技术问题是提供该黄绿蜜环菌发酵液有效部位的应用。
[0009]为解决上述问题，本发明所述的黄绿蜜环菌发酵液有效部位的制备方法，包括以下步骤:
⑴配制发酵培养液:由10~30%马铃薯浸提液、10~30%豆芽浸提液、5~10%葡萄糖、1~5%0KH2PO4,1-5% MgS04、0.1~1%。微量盐、0.l~lmg/L VBn0.l~lmg/L VB2配制而成的 pH 值为5.5-7.5的培养液； (2)制备黄绿蜜环菌发酵液:所述发酵培养液在温度为121°C、蒸汽压力为103KPa的条件下灭菌20min后，将其温度降至室温，并在该室温、无菌条件下，按5~10%的接种量接入黄绿蜜环菌生产菌种，在装料系数为65%~75%、搅拌速度为50~150rpm、通气量为0.1-0.3vvm、培养压力为0.01-0.05MPa、发酵温度为25~28°C条件下发酵10~15d，即获得黄绿蜜环菌发酵液；
⑶所述黄绿蜜环菌发酵液经减压浓缩至其体积的1/3~1/5时，即得黄绿蜜环菌发酵液浸膏；
⑷在所述黄绿蜜环菌发酵液浸膏中加入其体积5~10倍蒸馏水，在65~85°C下加热回流提取1~3次，每次3h，抽滤，合并得到滤液；所述滤液经减压浓缩后得到浓缩液A，该浓缩液A中加入其5~10倍体积的体积浓度为95%的乙醇进行醇沉，12~24h后分别得到上清液和醇沉物；所述醇沉物经真空冷冻干燥即得发酵液粗多糖有效部位；
(5)所述上清液用其体积10~30倍的丙酮在室温静置提取1~3次，每次提取60~84h，得到丙酮提取液，该丙酮提取液经减压浓缩后得到丙酮提取物；所述丙酮提取物中加入3~9倍体积的正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，得到溶解液，该溶解液过0.45 μ m有机滤膜，得到滤液；所述滤液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离，收集目标馏分，该目标馏分经减压干燥即得发酵液留醇类有效部位；或
将所述上清液经减压浓缩除去乙醇后，得到浓缩液B，该浓缩液B用其体积1~3倍的水溶液溶解后过MCI型树脂柱，并分别按2~5倍的柱体积用水、80%的乙醇-水洗脱，收集80%的乙醇-水洗脱液，该80%的乙醇-水洗脱液经减压干燥即得核苷类有效部位。
[0010]所述步骤⑵中黄绿蜜环菌是指采集于青海省海北州祁连县的黄绿蜜环菌Armillaria ii/ieo-Kireft?按常规方法经组织分离获得的黄绿蜜环菌；所述黄绿蜜环菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO:7356【保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期2013年3月18日】。
[0011]所述步骤(5)中正己烷-乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按I mL:l mL的比例混合而成的溶液。
[0012]所述步骤⑶、步骤⑷、步骤(5)中的减压浓缩及减压干燥的条件均是指真空度为
0.06-0.09 MPa,温度为 50-65 °C。
[0013]所述步骤⑷中的真空冷冻干燥的条件是指真空度为5~15Pa，干燥时间12~24h。
[0014]如上所述的黄绿蜜环菌发酵液有效部位的制备方法制得的黄绿蜜环菌发酵液有效部位的应用，其特征在于:该黄绿蜜环菌发酵液有效部位作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗氧化、抗肿瘤、改善睡眠、增强免疫力药用制剂，或作为有效组分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
[0015]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用深层发酵法生产黄绿蜜环菌发酵液，使至今无法人工栽培的黄绿蜜环菌这一珍稀资源实现了高效、持续、高值利用。
[0016]2、本发明采用的发酵培养液原料均为可食用农产品，不但价廉物美，而且食用安全。
[0017]3、本发明采用溶剂提取、离心、工业制备色谱等常规方法，从发酵液中分离制备的有效活性部位具有抗肿瘤、抗氧化、改善睡眠、提高免疫力的功能。
[0018]⑴黄绿蜜环菌发酵液留醇类有效部位抗肿瘤细胞活性试验
采用iCelIigence实时无标记细胞分析仪进行体外抗肿瘤细胞活性测定。
[0019]分别将对数生长期的人肝癌细胞IfepG2、小鼠肺癌细胞Lewis细胞，用胰酶消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于培养基(!fepG2细胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，Lewis细胞用含10%胎牛血清的F_12k培养基培养)中，并将细胞浓度调至2.85 X 14个/ml,得到对数生长期的H印G2和Lewis细胞悬液，并按345 μ L/孔、每孔1.0Χ104个细胞的量将所述细胞悬液接种入8孔细胞板中，室温放置30 min;将用DMSO配制成浓度为5mg/mL的黄绿蜜环菌发酵液留醇类有效部位样品溶液加入上述8孔板中，每孔加5 yL，并将8孔板置于iCelligence测试台，放入二氧化碳培养箱中开始检测；45h后得到黄绿蜜环菌发酵液留醇类有效部位抗肿瘤细胞活性检测图。其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应。
[0020]根据活性检测图中细胞增殖曲线的上升趋势，可判断细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定发酵液留醇类有效部位的体外抑制肿瘤细胞贴壁及增殖活性(图1、图2)。由图1、图2可知，黄绿蜜环菌发酵液甾醇类有效部位能够显著抑制!fepG2和Lewis细胞的贴壁和增殖。
[0021 ] ⑵黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位抗氧化活性试验
利用已建立的体外细胞抗氧化药物筛选模型(中国发明专利“一种抗氧化剂或化学预防剂筛选细胞系及其构建和应用”，公开号为CN102899351A)评估发酵液核苷类有效部位的相对抗氧化能力。以已知抗氧化剂特丁基对苯二酚(TBHQ)作为阳性对照，通过检测样品与对照组细胞中荧光素酶的活性，计算相同剂量条件下黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位抗氧化能力与TBHQ的抗氧化能力的倍数关系。
[0022]将经过筛选的对数生长期Hek293_ARE细胞经胰酶消化、计数后接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为2X104个，在37°C，5%的CO2培养箱中培养24h。为避免边缘效应，周围孔加入PBS ;每孔补充等量培养基。然后加入黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位，使得样品终浓度为20~50mg/mL，每个浓度设3个重复；同时分别设置5个空白对照和阳性对照，阳性对照药物特丁基对苯二酚(TBHQ)的终浓度同样为20~50mg/mL。将加入样品、对照品以及空白对照的细胞培养板放置在370C，5%0)2培养箱，继续培养24h，使用Steady-Glo?荧光素酶检测试剂盒检测各培养孔细胞中荧光素酶的活性，计算黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位相对抗氧化活性(图3)。由图3可知，黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位的相对抗氧化活性是阳性对照TBHQ相对抗氧化活性的1~30倍，说明黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位具有很强的抗氧化活性。
[0023]⑶黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位改善睡眠试验
采用动物实验模型评价黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位对小鼠睡眠的影响。
[0024]将黄绿蜜环菌发酵液核苷类有效部位、中药(枣仁安神胶囊)阳性对照药物、西药(艾司唑仑片)阳性对照药物分别充分研磨后，用生理盐水配制成一定浓度备用。除空白组夕卜，其余各组均按一定给药剂量每日灌胃给药一次，连