一种用于指导伊立替康类化疗药物个体化治疗的ugt1a1联合基因位点荧光检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于指导伊立替康类化疗药物个体化治疗的UGTlAl联合基因位 点荧光检测试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 最近几年，药物遗传学/药物基因组学在化疗药物作用机制等方面的研究获得了 突破性进展，发现化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的一种（一组）基因的表达和/ 或多态性显著相关。通过相关基因的检测，预测化疗药物的疗效，选择合适的药物进行个体 化化疗，已经成为提高疗效、减少无效治疗的合理选择。
[0003] 个体化化疗是根据癌症患者药物遗传学和药物基因组学特点，采用特异和最佳的 化疗药物方案进行化疗的方法。个体化化疗可以帮助患者选择合适的化疗药物，提高治疗 的针对性，最大程度的延长患者的生存期。
[0004] 伊立替康是目前治疗转移性结直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤最有效的化 疗药物之一。国外临床研究表明采用伊立替康为基础的化疗方案可以提高患者的化疗有 效率、无疾病进展生存时间（progression-free survival，PFS)和总生存时间（overall survival，OS)。在临床治疗肿瘤疾病的过程中，不同患者对化疗药物的疗效和耐受性存在 差异，有一部分患者因其毒性反应大而不能耐受，从而终止了化疗方案的治疗，甚至有个别 患者因其毒性反应没有得到有效的控制而导致临床死亡。
[0005] 现代药物基因组学研究证明，人类遗传和基因多态性是药物不良反应及其疗效 个体化差异的首要原因。近年来大量临床观察显示，肿瘤患者使用伊立替康化疗的安全性 与尿苷二磷酸葡糖苷酸转移酶 IAl (uridine diphosphate glucuronosyl transferases 1A1，UGT1A1)基因多态性有关。
[0006] UGTlAl基因的相关热点突变位点主要有UGT1A1*60 (-3279 T/G)， UGT1A1*93(-3156 G/A)，UGT1A1*28(-536/7)and UGT1A1*6(211 G/A)，UGT1A7*1，UGT1A7*2， UGT1A7*3, UCT1A7*4, UGT1A9 - 118(dT)9, UGT1A9 - 118(dT)10。国内大量的实验研究 表明，UGT1A1*6突变型（G/A和A/A)与野生型G/G相比，可以增加患者发生3级以上中 性粒细胞减少和腹泻的风险，与多项在日本的临床研究结果一致。各种研究及临床试验 表明，UGT1A1*28的突变型（TA6/7和TA7/7)与野生型TA6/6相比，可以增加患者发生3 级以上血小板减少的风险，但不会增加患者发生3级以上白细胞减少和中性粒细胞减少 的风险；消化道毒性方面，UGT1A1*28的突变型（TA6/7和TA7/7)与野生型TA6/6相比， 不会增加患者发生3级以上腹泻的风险。UGT1A1*60(_3279 G/G)，UGT1A1*93(-3156 A/ A)，UGTlAl*28(-537/7)and UGT1A1*6(211 T/T)纯合子出现的概率分别为 6.4%，L1%， I. 1%，2. 1%。发生3级粒细胞减少及腹泻的风险分别是53. 2%和12. 8%，与野生型相比， 28和93的突变型有更高的三级粒细胞减少的风险，突变型与三级粒细胞减少的风险无关。 28及93的携带者以及60的纯合子血液胆红素水平升高，但与剂量毒性无关。
[0007] 综合临床、科研以及文献，UGT1A1*60 (-3279 G/A)，UGT1A1*93 (-3156G/A)， UGTlAl*28(-536/7)和UGT1A1*6(211 T/G)这四个位点都有个体化用药指导意义。为此，本 发明针对UGTlAl基因的四个基因位点多态性所设计的试剂盒，从而更好地指导临床医生 优化化疗方案，以达到个体化医疗的目的。
[0008] 目前，检测UGTlAl基因多态性常用的方法是DNA直接测序法（毛细管电泳法）。 DNA直接测序法通过正反双向测序进行比较，是检测基因突变的金标准，但其操作步骤多， 需要对测序样品进行扩增、纯化、序列分析、判读等，可能增加错误的概率，而且反复开盖会 增加污染概率，工作量大且敏感性低，需要特殊且昂贵的设备，结果判读复杂，存在较大的 主观性，不适合临床常规检测。
[0009] 另外，国内已有多个相关的检测试剂盒，比如北京鑫诺美迪的UGT1A1*28基因突 变检测试剂盒，Third Wave，Genelex、Genzyme、LabCorp、上海申友生物和上海天昊生物等。 但都是只检测单个位点的试剂盒。广州益善生物技术有限公司的UGTlAl基因多态性检测 的方法及液相芯片法可以检UGT1A1*28, UGT1A1*6或UGT1A1*93基因型。但是芯片法的检 测成本高，而且开管操作，假阳性的出现比率高，虽然检测灵敏度相对较高，但对芯片检测 设备仪器的要求也成为临床检测的很大障碍，难以普及推广。
[0010] 本发明研制开发的检测试剂盒，以 UGTlAl*60(+3279 T/G)，UGT1A1*93(-3156 G/ A)，UGTlAl*28(-536/7)及UGT1A1*6(211 G/A)这四个位点为检测对象，以分子信标探针荧 光定量PCR为基础，对上述4个基因位点进行基因分型检测。此方法可实现对标本DNA基 因位点高特异性和高灵敏性的基因分型检测，且一次性可以检出四个位点的基因型，除此 之外，该方法操作简便，一步加样闭管检测，避免了 PCR污染；周期短，一次反应耗时1小时 左右；结果判读简单明了，且仪器普及程度较高，便于在临床检测的开展。一次性检测出四 个位点，大大节约了成本，为临床诊断和相关领域科研提供可靠方法。
【发明内容】
[0011] 本发明目的是提供一种可在1小时之内同时检测UGTlAl基因4个热点基因多态 性位点并且同时进行基因分型的荧光检测试剂盒。
[0012] 为了实现上述目的，采取的技术方案：一种用于指导伊立替康类药物个体化治疗 的UGTlAl基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和一系列标准品。
[0013] 所述扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCljP dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水， 高特异性扩增 UGT1A1*60 (-3279 T/G)，UGT1A1*93 (-3156 G/A)，UGT1A1*28 (-536/7)及 UGT1A1*6(211 G/A)的引物混合物，对上述位点进行特异性检测的分子信标荧光探针混合 物，对人基因组DNA进行检测的通用引物及探针混合物；
[0014] 所述一系列标准品包括：UGT1A1*60 (-3279 T/G)分型标准品，UGT1A1*93 (-3156 G/A)分型标准品，UGT1A1*28 (-536/7)分型标准品及UGT1A1*6 (211 G/A)分型标准品。
[0015] 所述用于对 UGT1A1*60 (-3279 T/G)，UGT1A1*93 (-3156 G/A)，UGT1A1*28 (-536/7) 及UGT1A1*6(211 G/A)基因分型检测的野生型及突变型特异型探针，对人基因组DNA进行 检测的通用探针被分为5组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5'端进行标记， 3'端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。
[0016] 所述探针所分为的四组为：用于对UGT1A1*60 (-3279 T/G)基因多态性位点野生 型及突变型特异型探针进行特异性检测的探针及对人基因组DNA进行检测的通用探针为 一组，采用3种不同荧光发光-淬灭基团；用于对UGT1A1*93(-3156 G/A)基因多态性位点 野生型及突变型特异型探针进行特异性检测的探针及对人基因组DNA进行检测的通用探 针为一组，采用3种不同荧光发光-淬灭基团；用于对UGT1A1*28 (-536/7)基因多态性位 点野生型及突变型特异型探针进行特异性检测的探针及对人基因组DNA进行检测的通用 探针为一组，采用3种不同荧光发光-淬灭基团；用于对UGT1A1*6 (211G/A)基因多态性位 点野生型及突变型特异型探针进行特异性检测的探针及对人基因组DNA进行检测的通用 探针为一组，采用3种不同荧光发光-淬灭基团；
[0017] 所述5'端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为：FAM、TET、HEX/J0E/VIC、 Cy3、TAMRA、ROX/Texas Red、Cy5 ;3'端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为： BHQI、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
[0018] 使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为 8. 0-9. 0,镁离子浓度为I. 5-3. OmM，4种dNTP的终浓度各为200-300 μ M，Taq酶的用量为 0. 1-0. 4U/ μ 1，引物探针混合物中的引物、探针的终浓度为0. 2-1 μΜ。
[0019] 使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中 同时扩增 UGT1A1*60(_3279 G > A) ;UGT1A1*93(-3156T > A) ;UGTlAl*28(-536/7)及 UGT1A1*6(211 G>A)4 个基因位点。
[0020] 用于UGT1A1*28 (-536/7)检测的引物为：
[0021] SEQ NO. 1 :5' -ACGCCCACTTGTCCTGGGCCTG-3'
[0022] SEQ NO. 2 :5' -ACACACACAGCAGCAGGC-3' ；
[0023] 用于UGT1A1*6(211 G > A)4检测的引物为：
[0024] SEQ NO. 3 :5, -AGTTGTCCTAGCACCTGACG-3'
[0025] SEQ NO. 4 :5' -AAAACATTATGCCCGAGACT-3' ；
[0026] 用于 UGT1A1*60(_3279 T > G) ;UGT1A1*93(-3156 G > A)检测的引物为：
[0027] SEQ NO. 5 :5' -TCTAGTTACATAACCTGAAACCCGG-3'
[0028] SEQ NO. 6 :5, -TTGCTCTCAAAACTCTGGG-3,；
[0029] 用于对人基因组DNA进行检测的通用引物为：
[0030] SEQ NO. 7 ：5r CAAAAGGGTCATCATCTCTGCC 3r
[0031] SEQNO-SiSr AGCGTGTCCATAGGGTGCCSr ；
[0032] 用于UGTlAl*28(-536/7)检测的野生型及突变型探针为：
[0033] 28_ff ： 5r cgcaGCCATATATATATATATAAGTAGACtgcg 3r
[0034] 28_M ： 5r cgcagCCATATATATATATATATAAGTAGGACtgcg 3r
[0035] 用于UGT1A1*6(211 G > A)4检测的野生型及突变型探针为：
[0036] 6*W :5，cgcggACGGAGCATTTTACACCTTGAAGACcgcg 3，
[0037] 6*M :5' cacgCAGAGACAGAGCATTTTACACCTTGAAcgtg 3，
[0038] 用于UGT1A1*60(_3279 T > G)检测的野生型及突变型探针为：
[0039] 60*W :5，cggacTCAGTTTGAACAAAGCAATTTGAGAAgtccg 3'
[0040] 60*M :5' cggacCAGTGTGAACAAAGCAATTTGAGAACtccg 3，
[0041] 用于UGT1A1*93(-3156 G > A)检测的野生型及突变型探针为：
[0042] 93*ff ： 5r CAGCGCAGCCCACCTGTCCAAGCTCGCTG 3r
[0043] 93*M ： 5r CACAGCCAGCCCACCTGTCTAAGCTCTGTG 3r
[0044] 用于对人基因组DNA进行检测的通用探针为：
[0045] SEQ NO.15 :5, -caggCTTCCTCACCTGATGATCTTGAGGCcctg-3，；
[0046] 所述各位点的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用荧光定量PCR进行实时 检测，通过与标准品的同步扩增和分析，得出所测标本的分型信息。
[0047] 其中所检测的人基因组DNA为：使用Chelex法、磁珠提取法、离心柱试剂盒法或酚 /氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为：来源于人类的：滤纸片 血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。
[0048] 使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应需在4通道或5通道的荧光定 量 PCR 仪上进行