一种线纹海马微卫星标记及其筛选方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微卫星标记技术领域，具体涉及一种线纹海马微卫星标记及其筛选方 法。
【背景技术】：
[0002] 海马，属海龙科（Syngthidae)、海马属（Hippocampus)，是一种名贵海洋中药材， 在我国素有"南方人参"之称，具有补肾壮阳、强心催产、止血镇痛、镇静安神的功效，同时 还具有很高的观赏价值和收藏装饰品的功能。在过去几十年中，由于长期过度捕捞、环境 污染和气候变化等因素，海马种质资源受到严重退化的威胁，有些海马种甚至到了灭绝的 边缘。为了有效保护海马的种质资源，38种海马被列入《世界自然保护联盟》（IUCN) 2012 年濒危动物红色名录。因此，研究其种群遗传结构和遗传变异水平至关重要。线纹海马 (Hippocampus erectus Perry，1810)主要分布在大西洋西岸，是典型的热带亚热带型海马 种群，其繁殖力强、个体较大、体型优美，其生长速率最快，目前已经发展为我国主要的养殖 品种之一。微卫星标记因具有多态性丰富、共显性、操作简便等优点，已经成为目前动植物 群体遗传分析、遗传背景分析、家系鉴定和野生资源保护等最常用的工具之一。然而，迄今 为止针对线纹海马开发的微卫星标记尚未有记载，亟待开发。另一方面，目前微卫星开发主 要采用富集文库法，需要进行DNA提取、基因组文库构建、探针杂交富集、克隆筛选等步骤， 费时费力，通常只能得到少量标记。因此急需一种高效的线纹海马微卫星标记开发技术。
【发明内容】
[0003] 本发明解决的技术问题在于针对现有线纹海马分子标记缺乏而提供一种微卫星 标记及其筛选方法。
[0004] 本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
[0005] 本发明首次公开了一种线纹海马微卫星标记，所述微卫星标记序列如SEQ. ID.N0:1~9中所示。
[0006] 本发明还提供了特异性扩增所述的线纹海马微卫星标记的引物，所述引物为SEQ. ID. NO ：10+SEQ. ID. NO ：IU SEQ. ID. NO ：12+SEQ. ID. NO :13^ SEQ. ID. NO ：14+SEQ. ID. NO :15^ SEQ. ID. NO :16+SEQ. ID. NO :17、SEQ. ID. NO :18+SEQ. ID. NO :19、SEQ. ID. NO :20+SEQ. ID. NO : 21、SEQ. ID. NO :22+SEQ. ID. NO :23、SEQ. ID. NO :24+SEQ. ID. NO :25 和 SEQ. ID. NO :26+SEQ. ID. NO ：27〇
[0007] 进一步地，本发明提供所述的线纹海马微卫星标记的筛选方法，所述方法步骤如 下：
[0008] SI.提取线纹海马样品的总RNA，合成cDNA、将cDNA文库进行均一化处理，建立测 序文库；
[0009] S2.采用Illumina HiSeq?2000测序，获得线纹海马原始序列；
[0010] S3.将步骤S2中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，对 其进行从头组装得到线纹海马的Unigenes ;
[0011] S4.对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查找；
[0012] S5.根据步骤S4中微卫星位点的两端序列设计特异性引物；
[0013] S6.提取线纹海马基因组DNA ;
[0014] S7.采用步骤S5中的特异性引物对步骤S6中的DNA进行PCR扩增；
[0015] S8.检测步骤S7中PCR产物的多态性，获得权利要求1所述的线纹海马微卫星标 记。
[0016] 本发明所述的构建方法高效、简便，能一次开发较多线纹海马微卫星标记。
[0017] 优选地，利用TRIzoI法对步骤S2中线纹海马的鳍条进行RNA提取。
[0018] 优选地，步骤S3中采用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到117327个 线纹海马的Unigenes。
[0019] 优选地，步骤S4中用MISA软件对步骤S3中的Unigenes序列进行微卫星位点查 找。
[0020] 用MISA软件在Unigenes序列中进行微卫星位点的查找，得到39848个含有微卫 星位点的序列，微卫星位点查找时重复次数为5~64,其中22582个单核苷酸重复序列， 9311个二核苷酸重复序列，7218个三核苷酸重复序列，645个四核苷酸重复序列，59个五核 苷酸重复序列，33个六核苷酸重复序列。
[0021] 在已获得的微卫星位点中随机选取，根据其两端序列，利用Primer5软件设计微 卫星位点的特异性引物，其中，筛选得到的具有扩增稳定、PCR产物杂带少的引物如表2所 示；
[0022] 优选地，步骤S6中线纹海马的DNA利用醋酸铵/异戊醇法对其鳍条进行提取。
[0023] 优选地，以DNA为模板，利用设计好的引物进行微卫星标记PCR扩增。步骤S7中的 PCR扩增的反应体系为10 μ L，包括：50ng基因组DNA，I XPCR缓冲液，Mg2+ (I. 5mM)，IU Taq 酶，dNTPs 0. 2mM，正反引物均为0. 25 μ Μ。
[0024] 优选地，步骤S7中的PCR扩增的反应程序为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，退 火30s (不同位点设计的特异性引物具有不同的最佳退火温度），72°C延伸30s，30个循环； 72°C延伸8min，最后4°C保存。
[0025] 优选地，步骤S8中的微卫星PCR产物的多态性利用8 %的非变性的聚丙烯凝胶电 泳进行验证。
[0026] 表1.本发明具有特异性的线纹海马微卫星引物序列信息
[0027]
CN 105177142 A 说明书 4/11 页
[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030] 1、本发明首次在线纹海马上建立了具有丰富多态性的微卫星标记，且对线纹海马 的家系鉴定准确率高达97%以上，为线纹海马的种群遗传结构、遗传育种、亲子鉴定等研究 提供了强有力的工具；
[0031] 2、本发明所使用的开发微卫星标记的方法，简便、快捷、高效，节约了人力和成本。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对 本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员 可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0033] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设 备。
[0034] 实施例1、线纹海马微卫星位点和特异性引物的获得和验证：
[0035] 线纹海马样品收集及RNA提取：
[0036] 从海马养殖公司中挑选30条健康、性腺发育良好的海马，剪取其背鳍鳍条，立即 提取total RNA，具体步骤如下：（1)将线纹海马的鳍条约50mg放入预冷的研钵中，利用液 氮迅速研磨成粉末，放入2mL离心管中，并加入ImLTRIzol ; (2)离心管中加入200 yL的 氯仿，剧烈震荡15s，室温静止3min，待溶液分层；（3)4°C，12, OOOr/min离心15min，吸取 上清放入新的离心管中；(4)加入与上清等体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置5-10min ; (5) 4°C，12, 000r/min离心10min，弃去上清，短暂离心，吸去剩余异丙醇；(6)加入ImL 75% 的乙醇，充分洗涤沉淀，4°C，7, 500r/min离心5min，短暂离心，吸去剩余乙醇，重复一次该 步骤；（7)室温晾干乙醇，加入20 μ LDEPC处理水使RNA充分溶解，-80°C保存备用；（8)取 IuL左右的样品进行电泳检测RNA质量，并用NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测RNA浓 度和质量。
[0037] 线纹海马转录组的测序、拼接及组装并查找微卫星位点：
[0038] 应用SMART?cDNA文库构建技术，对RNA样品进行cDNA的双链合成，用 Trimmer-direct cDNA normalization kit 对全长 cDNA 进行均一化处理。米用 Illumina Hi SeqTM2000进行测序，获得原始序列。去除原始序列的接头和低质量序列，获得高质量序 列，采用Trinity软件对其进行从头组装，得到117327个线纹海马的Unigenes。
[0039] 用MISA软件在Unigenes序列中进行微卫星位点的查找，得到39848个微卫星位 点，微卫星位点查找时重复次数为5~64,其中22582个单核苷酸重复序列，9311个二核 苷酸重复序列，7218个三核苷酸重复序列，645个四核苷酸重复序列，59个五核苷酸重复序 列，33个六核苷酸重复序列。
[0040] 线纹海马基因组DNA提取：
[0041] 线纹海马DNA的制备采用醋酸铵/异戊醇法进行，具体步骤如下：（1)将线纹海 马的鳍条约50mg放入2mL离心管中；（2)离心管中加入600 μ L的组织裂解液（Tris-HCl 100mM，pH 8.0 ;EDTA 50mM，pH 8.0 ;SDS 1%，pH 8.0 ;NaC1125mM)，用干净的剪刀将组织 剪碎；（3) 65°C水浴2~4h，每隔半个小时轻轻颠倒混匀；（4)冷却到室温；（5)向离心管中 加入200 μ L的7· 5M的醋酸铵（NH4AC)，混勾，冰上放置5~IOmin ; (6) 4°C，12000r/min离 心lOmin，并转移上清液（约500 μ L)到另一干净I. 5mL离心管中；（7)加入等体积的异丙 醇，轻摇，放置1~2min ; (8)4°C，12000r/min离心10min，弃上清液；（9)加入1ml 70%预 冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以适量TE溶液（200-500 μ L)溶解DNA样品，每个 DNA样品加入10mg/mL RNA酶1 μ L ; (10)取IuL左右的样品进行电泳检测DNA质量，并用 NanoDropND-1000紫外分光光度仪检测DNA浓度和质量；（11)将得到的DNA用双蒸水稀释 成IOOng/ μ L的工作液，-20°C备用。
[0042] 微卫星位点PCR扩增和多态性验证：
[0043] 以线纹海马的DNA为模板，在已获得的微卫星位点中随机选取，根据其两端序列， 利用Primer5软件设计微卫星位点的特异性引物，进行PCR扩增，体系为10 μ L，包括50ng 基因组 DNA，I XPCR 缓冲液，Mg2+ (I. 5mM)，IU Taq 酶，dNTPs 0· 2mM，正反引物均为 0· 25 μ Μ。 PCR反应程序为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，退火30s (各个微卫星位点的最佳退火温 度不同），72°C延伸30s，30个循环；72°C延伸8min，最后4°C保存。
[0044] PCR扩增完成后，利用8 %的非变性聚丙烯凝胶电泳验证其多态性，具体步骤如 下：（1)胶的制备：用自来水和洗涤剂把玻璃长板和耳板洗净晾干后夹紧，配制PAGE胶（纯 水41mL，5XTBE