香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用 途，具体涉及一种从药用植物山芝麻中分离得到的香豆素类化合物6, 7, 9α-三羟 基-3, 8, 11 a -三甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 据有关统计显示，全世界约有3亿多人为慢性乙肝病毒（HBV)携带者，我国约占半 数。乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以导致 慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此成为影响人类寿命的九大疾病之一。由于慢性HBV感 染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217,因此在全世界每年大约有200万人死于乙 肝引起的肝硬化和肝癌，而我国又是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关 的慢性肝病（肝硬化与肝癌）。上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求 高效低毒的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。
[0003] 药物化学工作者在筛选抗HBV药物的过程中进行了不懈的努力，但到目前为止还 在寻找能治愈HBV感染的特效药。临床上已获得FDA正式批准使用的α -干扰素和核苷类 药物拉米呋啶能在某种程度上获得治疗效果，但对大多数病人还达不到治愈的目的，且停 止治疗后的"反跳"现象是医药工作者最感棘手的问题，所以开发研制高效、低毒、不"反跳" 的抗HBV新药向药物化学工作者提出了挑战。在筛选抗HBV新药的过程中，越来越多的药 物化学工作者将注意力转向了植物来源丰富、价廉易得、毒副作用小、分子结构复杂多样的 天然化合物。
[0004] 山芝麻为梧桐科植物山芝麻（Helicteres angustifolia L.)的干燥根或全株，味 苦、性寒，归肺、大肠经，可解表清热、解毒消肿，用于治疗感冒发热、痄腮、乳娥、麻疹、咳嗽、 泄泻痢疾、痈肿。药理研究表明山芝麻具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗肿瘤等活性。有研究表 明山芝麻粗提物具有抗HBV活性，但对其抗HBV的药效物质却缺乏研究，迄今为止，尚未见 有关涉及本发明的6, 7, 9 α -三羟基-3, 8, 11 α -三甲基环己烷嵌-[d，e]-香豆素抗HBV活 性的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从山芝麻中分离得到的香豆素类化合物6, 7, 9 α -三羟 基-3, 8, 11 α -三甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
[0006] 本发明应用现代药理筛选方法，从梧桐科山芝麻属（Helicteres)植物山芝麻 (H. angustifolia)中提取分离得到1个香豆素类化合物：6, 7, 9 α -三羟基-3, 8, 11 α -三 甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素，并经与阳性对照拉米呋啶药理试验比较，结果证实前者具 有显著的抗乙肝病毒作用，对HBsAg的IC 5。值为11. 8 μ g/ml，对HBeAg的IC5。值为34. 2 μ g/ ml，显著高于阳性对照拉米呋啶。
[0007] 本发明所述的活性化合物具有如下的化学结构：
[0008]
[0009] 本发明的化合物通过下述方法制备：
[0010] 取山芝麻干燥根25kg，95%乙醇回流提取，浓缩后分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁 醇萃取，共得0. 95kg，取乙酸乙酯萃取物200g进行硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱，所得流份以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱、MPLC和半制备HPLC等分离纯化手段分离 得到化合物6, 7, 9 a -三羟基-3, 8, 11 a -三甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素。
[0011] 本发明所述的6, 7, 9 Ct -三羟基-3, 8, 11 Ct -三甲基环己烷嵌-[d，e]-香豆素可作 为活性成分用于制备抗HBV的药物。
【附图说明】
[0012] 图1是6, 7, 9 a -三羟基-3, 8, 11 a -三甲基环己烷嵌-[d，e]-香豆素的提取分离 工艺流程图。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1制备6, 7, 9α-三羟基-3, 8, Ila-三甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素
[0014] 取山芝麻干燥根25kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合 并提取液并浓缩得浸膏〇.95kg，加水（4L)混悬，分别以等体积石油醚、乙酸乙酯和正 丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物200g。将乙酸乙酯萃取部 位经硅胶（200-300目）柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脱， 得到11个流份（Fr.l-ΙΙ)，其中流份Fr.3(32g)再经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇， 30:1,20:1，10:1,5:1,3:1，1:1)、MPLC(甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脱）和半制备 HPLC 等手段纯化，分离得到化合物6, 7, 9 a -三羟基-3, 8, 11 a -三甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆 M (6, 7, 9 a -trihydroxy-3, 8, 11 a -trimethylcyclohex〇-[d, e]-coumarin, I)〇
[0015] 所得化合物为棕色无定型粉末，[n原：+27. 6(c I. 15，Me0H) ;UV(MeOH) λΜχ nm(l og ε ) ：322. 3(3. 54), 210. 6(4. 67) ；IR(KBr) : unax(cm :3358, 2939, 1687, 1626, 1562, 1392 ，1238 ;ESI-MS m/z: 277 [M+H]+。1H-NMR (600MHz, DMS0-d6) δ H: 4· 90 (1H, brs, H-9)，3· 33 (1H, m，H-I I)，2. 19 (3H，s，13-0CH3)，2. 10 (3H，s，12-0CH3)，2. 06 (1H，brd，J = 14. 4Hz，H-lOa)，I. 85 (1H，m，H-lOb)，I. 37 (3H，d，J = 7. 2Hz，H-OCH3) ;13C-NMR(150MHz，DMS0-d6) δ c: 163. I (C-2)，147. 7 (C-8a)，147. 5 (C-7)，145. 7 (C-6)，139. 0 (C-4)，125. I (C-5)，117. 2 (C-3)，109. 4 (C -8)，107. 5 (C-4a)，62. 8 (C-9)，35. 6 (C-10)，25. 6 (C-l I)，22. I (H-OCH3)，12. 2 (12-0CH3)，8. 9(13-0CH3) o
[0016] 实施例2体外抗HBV实验
[0017] 应用Ifep G2的2. 2. 15细胞株（教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室， 上海），以每孔IOX IO5个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含10 %胎牛血清， 38〇μ8/πι1 G418,0.03%谷胺酰胺，青霉素、链霉素各lOOμg/ml，在5% CO2孵箱中37°C培 养，48小时后，换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液，每种药物设3~5个浓度，每个浓 度设4个平行孔，继续培养9天（每3天换液一次），收集上清液用ELISA检测HBsAg及 HBeAg含量。同样条件下以不含药物的培养液上清液作为对照组。同时用上述细胞株，用 MTT法测定药物的细胞毒性。阳性对照为拉米呋啶（3TC)，结果证实本发明所述化合物具有 显著的抗HBV活性，且有效浓度低，其对HBsAg的IC 5。值为IL 8 μ g/ml，对HBeAg的IC5。值 为34. 2 μ g/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶（如表1所示）。
[0018] 表1.化合物1对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用
[0020] / :当细胞毒性> 25%时不进行抑制率测试
[0021] 本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。
【主权项】
1. 6, 7, 9 (I -三羟基-3, 8, 11 (I -三甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素在制备抗乙肝病毒药 物中的用途，2. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物通过下述方法制备： 取山芝麻干燥根，95%乙醇回流提取，浓缩后分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取， 得乙酸乙酯萃取物，取乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，所 得流份以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱、MPLC和半制备HPLC分离纯化，得到化合物 6, 7, 9 α -三羟基-3, 8, 11 α -三甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素。3. 按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物6, 7, 9 α -三羟基-3, 8, 11 α -三 甲基环己烷嵌-[d，e]_香豆素抗HBV活性。
【专利摘要】本发明属于医药领域，涉及一种香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。本发明从山芝麻属Helicteres植物山芝麻H.angustifolia中提取分离得到一种香豆素类化合物6,7,9α-三羟基-3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素并证实其抗乙肝病毒活性。所述的化合物经与阳性对照拉米呋啶药理试验比较，结果证实前者具有显著的抗乙肝病毒作用，对HBsAg的IC50值为11.8μg/ml，对HBeAg的IC50值为34.2μg/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶，可作为活性成分用于制备抗乙肝病毒的药物。
【IPC分类】A61K31/37, C07D311/92, A61P31/20
【公开号】CN105520937
【申请号】CN201410505699
【发明人】陈道峰, 殷翔, 史训龙, 朱海燕, 卢燕
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年9月28日