抑制nadph氧化酶活性的组合物的制作方法
【专利说明】抑制NADPH氧化酶活性的组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及用于预防或治疗与NADPH氧化酶活性相关或有关的医学状况的组合物 和方法。更具体地，本发明涉及这样的组合物和方法，其应用藻胆素作为前体药物并且在其 施用给哺乳动物对象以抑制NADPH氧化酶活性时转化为藻玉红素(phycorubin)。 发明背景
[0002] NADPH氧化酶将电子从NADPH传递给氧，导致产生活性氧种类(ROSs)，包括〇2一和 H2O2 JADPH氧化酶在嗜中性粒细胞中表达，其中利用活性氧种类裂解来杀死病原体。NADPH 氧化酶表达和活性也可在哺乳动物身体的其它细胞和组织中观察到，其中NADPH氧化酶起 着细胞内信号转导通路的调节剂作用。
[0003 ]遗憾的是，在高比例的非感染性病理中，NADPH氧化酶在受到侵袭的组织中过量表 达和/或过度活化，并且导致的氧化剂产生经常介导或加剧病状。实际上，在大多数病理性 病症中，活化的NADPH氧化酶表现为过度氧化应激(oxidant stress)的主要来源。NADPH氧 化酶的过度活性可以刺激促炎机制，促进组织纤维化和骨吸收，并且，在血管系统中拮抗一 氧化氮的重要保护活性。由NADPH氧化酶产生的氧化剂也可能诱导包括DNA的关键细胞靶标 的结构损害，并且可能增强癌症的生长因子活性(Meyer JW等人，FEBS Lett 2000:472:1-4;Zalba G等人，Hypertension 2001;38:1395-9; Inoguchi T等人，J Am Soc Nephrology 2003; 14:S227-32;Li JM等人，Hypertension 2002;40:477-84;Bateller R等人，J Clin Invest 2003:112:1383_94;Darden AG等人，J Bone Mineral Res 1996;11:671-5; Ohshima H 等人，Arch Biochem Biophys 2003;417:3_ll;Mander P 等人，J Neuroinflammation 2005;2:20;Brar SS等人，Am J Physiol Cell Physiol 2002;282: C1212-24;以及下面的其它引用）。因而，在医学科学家中普遍的观点是实现NADPH氧化酶活 性的部分抑制的安全策略会具有预防和/或治疗许多病症的显著效用。
[0004] 实际上，现在认为某些常用药物一一包括他汀类和ACE抑制剂一一的有益效果在 某些组织中部分地是由间接抑制NADPH氧化酶活性进行介导的。然而，到目前为止，现在没 有药物或植物营养素(phytonutrient)可用于能够在大多数或所有组织中直接抑制NADPH 氧化酶活性的临床或饮食用途。
[0005] 因此，所需要的是NADPH氧化酶抑制剂，其能够被容易地大量生产，能够用于抑制 NADPH氧化酶活性并且可以用于防止或治疗与NADPH氧化酶活性有关的状况。 发明简述
[0006] 本发明的一个方面涉及用于施用给哺乳动物对象的藻化学(phycochemical)组合 物。所述藻化学组合物具有抑制NADPH氧化酶活性的前体药物活性。该藻化学组合物包括溶 解或悬浮在药学上可接受载体中的分离的藻胆素和具有用于容纳所述分离的藻胆素的凝 胶包装的胶囊。所述分离的藻胆素在被施用到所述哺乳动物对象以用于抑制NADPH氧化酶 活性时转化为藻玉红素。在优选的实施方式中，所述分离的藻胆素选自藻蓝胆素、藻红胆 素、植物生色胆素 (phytochromobi I in)，每一种藻胆素任选地包括结合到其上的藻蓝蛋白 肽片段。在进一步优选的实施方式中，药学上可接受的载体是干的，并且胶囊任选地是硬凝 胶。在进一步优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体是液体，并且所述胶囊任选地是 软的。在其它优选的实施方式中，所述藻化学组合物进一步包括选自下述的一种或多种成 分:叶酸、L-精氨酸、普利醇(policosanol)、大豆异黄酮、绿茶提取物、牛磺酸、辅酶Q10、钾 盐、镁、鱼油、维生素 C、硒、叶黄素、玉米黄质（zeathanthin)、锌、苯磷硫胺(benfotiamine) 和吡哆胺。本发明的该方面，即，含有溶解或悬浮在药学上可接受载体中的分离的藻胆素的 胶囊可以由本领域普通技术人员根据本文提供的说明、通过改良本领域内已知的传统方法 容易地制造。
[0007] 本发明的另一方面涉及用于施用给哺乳动物对象的另一藻化学组合物。同样，所 述藻化学组合物具有抑制NADPH氧化酶活性的前体药物活性。然而，在本发明的此方面，藻 化学组合物包括与药学上可接受载体物质或食品级填料混合并被压成片剂的分离的藻胆 素。所述分离的藻胆素在施用给哺乳动物对象以用于抑制NADPH氧化酶活性时转化为藻玉 红素。在优选的实施方式中，所述分离的藻胆素选自藻蓝胆素、藻红胆素、植物生色胆素，每 一种藻胆素任选地包括结合到其上的藻蓝蛋白肽片段。在其它优选的实施方式中，所述藻 化学组合物进一步包括选自下述的一种或多种成分:叶酸、L-精氨酸、普利醇、大豆异黄酮、 绿茶提取物、牛磺酸、辅酶Q10、钾盐、镁、鱼油、维生素 C、硒、叶黄素、玉米黄质、锌、苯磷硫胺 和吡哆胺。本发明的该方面，即，通过压制与药学上可接受的载体物质或食品级填料混合的 藻胆素制成的片剂，可以由本领域普通技术人员根据本文提供的说明、通过改良本领域内 已知的传统方法容易地制造。
[0008] 本发明的另一方面涉及用于肠胃外施用给哺乳动物对象的进一步的藻化学组合 物。同样，所述藻化学组合物具有抑制NADPH氧化酶活性的前体药物活性。然而，在本发明的 此方面，藻化学组合物包括溶解或悬浮在适合注射的生理学上可接受的无菌溶剂中的分离 的藻胆素。所述分离的藻胆素在施用给哺乳动物对象以用于抑制NADPH氧化酶活性时转化 为藻玉红素。在优选的实施方式中，所述分离的藻胆素选自藻蓝胆素、藻红胆素、植物生色 胆素，每一种藻胆素任选地包括结合到其上的藻蓝蛋白肽片段。适合注射的生理学上可接 受的无菌溶剂通过本领域普通技术人员已知的传统方法和本文所描述的方法来制造。本发 明的该方面，即，溶解或悬浮在适合注射的生理学上可接受的无菌溶剂中的分离的藻胆素 可以由本领域普通技术人员根据本文提供的说明、通过改良本领域内已知的传统方法容易 地制造。
[0009] 本发明的另一方面涉及用于局部施用给哺乳动物对象的藻化学组合物。同样，在 本发明的此方面，所述藻化学组合物具有抑制NADPH氧化酶活性的前体药物活性。然而，所 述藻化学组合物包括溶解或悬浮在皮肤病学上可接受的润肤载体中的分离的藻胆素。所述 分离的藻胆素在局部施用给哺乳动物对象以用于抑制NADPH氧化酶活性时转化为藻玉红 素。在优选的实施方式中，所述分离的藻胆素选自藻蓝胆素、藻红胆素、植物生色胆素，每一 种藻胆素任选地包括结合到其上的藻蓝蛋白肽片段。在另一优选的实施方式中，所述藻化 学组合物作为防晒剂起作用。本发明的该方面，即，从溶解或悬浮在皮肤病学上可接受的润 肤载体中的分离的藻胆素制成的局部组合物可以由本领域普通技术人员根据本文提供的 说明、通过改良本领域内已知的传统方法容易地制造。
[0010]本发明的另一方面涉及营养食品（nutraceutical)组合物。所述营养食品组合物 包括与分离的藻胆素混合的营养物质。在优选的实施方式中，所述分离的藻胆素选自藻蓝 胆素、藻红胆素、植物生色胆素，每一种藻胆素任选地包括结合到其上的藻蓝蛋白肽片段。 本发明的该方面，即，具有与分离的藻胆素混合的营养物质的营养食品组合物可以由本领 域普通技术人员根据本文提供的说明、通过改良本领域内已知的传统方法容易地制造。
[0011] 本发明的另一方面涉及药用化妆品（cosmeceutical)组合物。所述药用化妆品组 合物包括与分离的藻胆素混合的化妆品物质。在优选的实施方式中，所述分离的藻胆素选 自藻蓝胆素、藻红胆素、植物生色胆素，每一种藻胆素任选地包括结合到其上的藻蓝蛋白的 肽片段。本发明的该方面，即，药用化妆品组合物包含与分离的藻胆素混合的化妆品物质， 可以由本领域普通技术人员根据本文提供的说明、通过改良本领域内已知的传统方法容易 地制造。
[0012] 本发明的另一方面涉及预防或治疗对象的与NADPH氧化酶活性相关或有关的医学 状况的方法。所述方法包括步骤：以预防或治疗有效量给对象施用一种或多种分离的藻胆 素，用于预防或治疗与NADPH氧化酶活性相关或有关的医学状况。所述医学状况可以选自缺 血性心脏病、心肌梗死、中风、外周动脉粥样硬化、脑血管粥样硬化、左心室肥厚、充血性心 力衰竭、高动脉压、肺动脉高压、勃起机能障碍、代谢综合症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性 神经病、糖尿病性肾病变、肾小球硬化症、肺气肿、哮喘、变态反应、骨质疏松、骨关节炎、胃 溃疡、败血症性休克、纤维化、肺纤维化、肝纤维化、帕金森氏病、阿尔茨海默病性痴呆、对皮 肤的紫外损害、癌症、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、硬皮病、病理性血管发生、移植排斥 和慢性疼痛综合症/痛觉增敏。在本发明的此方面的优选方式中，藻胆素选自藻蓝胆素、藻 红胆素、植物生色胆素，每一种藻胆素任选地包括结合到其上的藻蓝蛋白肽片段。所述藻胆 素可以口服、肠胃外或局部施用。 附图简述
[0013]图IA和IB说明了藻胆素提取物对人动脉内皮细胞中的NADPH氧化酶的抑制。源自 动脉内皮的人细胞培养物与NADPH温育，以通过细胞NADPH氧化酶诱导过氧化物产生。通过 光泽精化学发光（lucigenin chemiluminescence)量化过氧化物的产生。光泽精是过氧化 物的特异检测剂。二亚苯基碘输（Dipheny Ieneiodonium)---种已知的NADPH氧化酶抑 制剂--显示完全抑制由加入的NADPH诱导的过量过氧化物产生。以300nM至20μΜ范围的浓 度将藻蓝胆素(PCB，图1Α)或胆绿素(BVD，图1Β)加入到NADPH处理的细胞培养物中。胆绿素 是另一已知的NADPH氧化酶抑制剂。藻蓝胆素和胆绿素都显示出对NADPH氧化酶过氧化物产 生的剂量依赖性抑制。20μΜ藻蓝胆素对人动脉内皮细胞中的NADPH氧化酶活性的抑制效果 与DPI的抑制效果相当。
[0014]图2A和图2B说明了藻胆素提取物对人动脉平滑肌细胞中NADPH氧化酶的抑制。源 自动脉平滑肌的人细胞培养物与NADPH温育，以通过细胞NADPH氧化酶诱导过氧化物的产 生。通过光泽精化学发光量化过氧化物的产生。光泽精是过氧化物的一种特异检测剂。二亚 苯基鹏镇一种已知的NADPH氧化酶抑制剂 显不完全抑制由加入的NADPH诱导的过 量过氧化物的产生。以300nM至20μΜ范围的浓度将藻蓝胆素(PCB，图2A)或胆绿素(BVD，图 2Β)加入到NADPH处理的细胞培养物中。胆绿素是另一已知的NADPH氧化酶抑制剂。藻蓝胆素 和胆绿素都显示出对NADPH氧化酶过氧化物产生的剂量依赖性抑制。20μΜ藻蓝胆素对人动 脉平滑肌细胞中的NADPH氧化酶活性的抑制效果与DPI的抑制效果相当。
[0015]图3A和图3B说明了藻胆素提取物对人肾系膜细胞中NADPH氧化酶的抑制。源自肾 系膜组织的人细胞培养物与NADPH温育，以通过细胞NADPH氧化酶诱导过氧化物的产生。通 过光泽精化学发光量化过氧化物产物。光泽精是过氧化物的一种特异检测剂。二亚苯基碘 #--一种已知的NADPH氧化酶抑制剂--显示完全抑制由加入的NADPH诱导的过量过氧 化物的产生。以300nM至20μΜ浓度的范围将藻蓝胆素(PCB，图3A)或胆绿素（BVD，图3B)加入 到NADPH处理的细胞培养物中。胆绿素也起抑制NADPH氧化酶的作用，因为其在细胞内被转 化为胆红素。藻蓝胆素和胆绿素都显示出对NADPH氧化酶过氧化物的产生的剂量依赖性抑 制。20μΜ藻蓝胆素对人肾系膜细胞中的NADPH氧化酶活性的抑制效果小于DPI的抑制效果， 但具有统计学意义。
[0016]图4A和图4B说明了由胆绿素还原酶介导的胆绿素和藻胆素到胆红素和藻玉红素 的转化。图4A描述了胆绿素和主要的藻胆素:藻蓝胆素、植物生色胆素和藻红胆素的同源化 学结构。图4B描述了胆红素和藻玉红素:藻蓝玉红素(phycocyanorubin)、植物生色玉红素 (卩1^1：0(3111'01]101'1113；[11)和藻红玉红素(。115^06巧1：111'01'1113；[11)的同源化学结构。箭头代表存在 于哺乳动物细胞中的胆绿素还原酶的催化活性。 发明详述
[0017] 本文公开了藻玉红素直接并有效地抑制NADPH氧化酶，以及当藻胆素被施用给哺 乳动物对象或以另外的方式被放置与胆绿素还原酶接触时被转化为藻玉红素。因此，藻胆 素起前体药物或藻玉红素的前体的作用并且可以用于预防或治疗与NDPH氧化酶活性相关 或有关的医学状况。
[0018] 藻胆素是在植物、藻类和蓝细菌中发现的发色团化合物家族。在此应用的优选的 藻胆素包括藻蓝胆素、藻红胆素和植物生色胆素。实际上，藻胆素共价结合到脱辅基蛋白质 上;得到的全蛋白质，称为藻青蛋白，其具有获取光能的作用。 1.定义
[0019] NADPH氧化酶是指将还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)氧化，同时使 分子氧还原为过氧化物的酶复合物。
[0020] 如本文所定义的，术语"分离的"表示目标化合物(一种或多种）已经基本上从其实 际存在的周围环境中纯化出来。例如，实际上，藻胆素结合到脱辅基蛋白质上，其中所述脱 辅基蛋白结合形式是指藻青蛋白，因此，在本文的一个实施方式中，分离的表示将藻胆素连 接到藻青蛋白脱辅基蛋白的硫醚键已经断裂，并且得到的游离藻胆素被提取和浓缩，以使 得到的浓缩物基本上不含藻青蛋白全蛋白或脱辅基蛋白。
[0021] 如本文所定义的，术语"藻化学组合物"表示源自植物或果实的组合物。
[0022] 如本文所定义的，术语"营养食品组合物"表示要求对人的健康具有医学作用的已 加工食品，或可选地，具有传统食品中存在的化学成分的组合物。
[0023] 如本文所定义的，术语"营养物质"表示存在于传统食品并且具有营养价值的化学 成分。
[0024] 如本文所定义的，术语"药用化妆品组合物"表示要求对人的健康具有医学作用或 药物样益处的化妆品。
[0025]如本文所定义的，术语"化妆品物质"表示存在于传统化妆品的任何功能性化学成 分，其赋予了化妆特性。
[0026]如本文所定义的，术语"局部施用"表示其中生物活性物质被应用于皮肤的任何输 送方式。