一种二萜化合物在制备抑制乳腺癌的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化合物药用领域，具体涉及从芫花中分离得到的一种新的二萜化合物 在制备抑制乳腺癌的药物中的医药用途。
【背景技术】
[0002] 芫花又称紫芫花、南芫花、头痛花、药鱼草等，始载于《神农本草经》，列为下品，为 传统的峻下逐水药。《本草纲目》列入毒草类，按《吴普本草》谓芫花"二月生青叶，加厚则黑， 花有紫、赤、白者，三月实落尽，叶乃生。"韩保昇《蜀本草》谓"近道处处有之，苗高二三尺。叶 似白前及柳叶，根皮黄似桑根，正月二月花发，紫碧色，叶未生时收。"结合《本草图经》"安徽 滁州芫花"和"四川锦州芫花"附图看，古今药用芫花品种一致，其原植物均为Daphne genkwa sieb.Et zucc·无疑。《中国药典》2010版收载其为瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香属 (Daphne)植物芫花(Daphne genkwa sieb et zucc)的干燥花蕾。谢宗万曾对芫花进行了本 草学考证，确证了历代本草中所记载的芫花应该为紫芫花Daphne genkwa sieb.Et zucc的 干燥花蕾。该植物为全国大多数地区临床习用的品种，其野生主要产于河南、山东、江苏、安 徽、四川等省，河南省主要分布在信阳、南阳等地的山区。
[0003] 到目前为止，从芫花的花、花蕾、叶、枝条、根中提取分离出化合物有70多种，其中 含有黄酮类成分、二萜原酸酯类成分、香豆素类成分、绿原酸类成分、木脂素类成分、酚苷类 等多种成分。
[0004] 芫花为传统的峻下逐水药，有毒，功能泻水逐饮，解毒杀虫，现代研究表明其具有 以下药理作用:①利尿作用;②镇咳祛痰作用;③杀虫、抗寄生虫作用;④引产作用;⑤抗炎、 抗肿瘤作用;⑥免疫调节作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从芫花中分离得到的一种二萜类化合物在制备抑制 乳腺癌的药物中的新用途，以及该二萜类化合物作为有效成分制成的组合物在制备抑制乳 腺癌的药物中的新用途。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -种二萜化合物在制备抑制乳腺癌的药物中的应用，所述二萜化合物芫花提取物 中分离获得，二萜化合物具有下述结构式的化合物(I): LziN 丄UDD乙乙O Λ _/·!·? 乙/ i X
C I )〇：
[0009]作为优选，所述二萜化合物芫花提取物中分离包括如下步骤：
[0010] a、将干燥的芫花粉碎，用75%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次 用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正 丁醇萃取物；
[0011] b、步骤a中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，依次用10%乙醇和75%乙醇洗脱，收 集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏；
[0012] C、步骤b中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、40:1、20:1、 10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」5个组分；
[0013] d、步骤C中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25 : 1、20:1和10:1的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
[0014] e、步骤d中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的 甲醇水溶液等度洗脱，收集9-13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0015] 作为优选，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0016] -种药物组合物在制备抑制乳腺癌的药物中的应用，药物组合物由含有治疗有效 量的权利要求1所述的化合物(I)和药学上可接受的载体组成。
[0017] 本发明在制备抑制乳腺癌的药物中的应用时，可以直接使用，或者以药物组合物 的形式使用。实验表明，上述二萜化合物（I)直接使用可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，发挥抗 肿瘤作用。具体是，二萜化合物（I)可使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显 示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应。以二萜化合物（I)的治疗有效量为主药 作为药物组合物的形式使用时，可药用载体或赋形剂可以是一种或多种选自固体、半固体 和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式 使用。即本发明化合物（I)作为药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于 口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、 口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等，均具 有很好的抑制乳腺癌的作用。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式；
[0019]图2为不同剂量化合物(I)对乳腺癌细胞增殖活力的影响；
[0020]图3为不同剂量化合物(I)对乳腺癌细胞凋亡的影响。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0023] 药材和试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海 凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。芫花购自安徽亳 州中药材市场，产地福建。
[0024] 制备方法：（a)芫花(8kg)粉碎至绿豆大小，用75%乙醇热回流提取(25LX3次），合 并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯(6L X 3次)和水饱和的正 丁醇(6LX 3次)萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(315g)和正丁醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用纯净水溶解至2L，医用脱脂棉过滤，滤液用AB-8型大孔 树脂（I.5kg)分离，依次用10%乙醇（IOL)和75% (12L)乙醇洗脱，收集75%乙醇洗脱液，减 压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏（155g); (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用200-300目正相 硅胶分离，依次用体积比为80:1 (10个柱体积）、40:1 (8个柱体积）、20:1 (8个柱体积）、10:1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组 分3(36g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1 (8个柱体积）、20:1 (8个 柱体积)和10:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2 (12g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶0DS-C18分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液 等度洗脱，收集9-13个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)(25mg)。
[0025] 结构确证:HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z 401.1612,结合核磁特征可得分子式为 C20H26O7，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d 6，500MHz): H-I (1 · 95，m)，H-I (2.07，m)，H-2(1.63，m)，H-2(2.86，m)，H-3(4.63，m)，H-4(1.98，br，s)，H-6(4.61，t，J= 8.9)，H-7(2.26，dd，J=14.4,8.4)，H-7(1.80，dd，J=14.4,9.6)，H-10(2.24，m)，H-11 (2.20，dd，J=14.4,8.4)，H-ll(2.33，dd，J=14.4,6.0)，H-12(5.29，dd，J = 8.4，6.0)，H-14(6.28，br，s)，H-15(7.38，br，s)，H-16(7.35，br，s)，H-17(1.21，s)，H-19(1.37，s)，H-20 (5.25,8) ;核磁共振碳谱数据5。（？？111，0130-(16，125泡）：18.2(〇1 2，1-〇,25.0(〇12,2-〇， 72.1(CH，3-C)，54.9(CH，4-C)，39.1(C，5-C)，84.6(CH，6-C)，41.8(CH2,7-C)，73.2(C，8-C)， 56.0(C，9-C)，42.7(CH，10-C)，40.0(CH2，11-C)，70.6(CH，12-C)，128.9(C，13-C)，108.2 (CH，14-C)，144.0(CH，15-C)，138.5(CH，16-C)，26.9(CH 3，17-C)，177.8(C，18-C)，29.6(CH3， 19-C)，105.8(CH，20-C);碳原子标记参见图I。IR光谱显示该化合物含有羟基和内酯基团 (3444cm- 1和1770cm-4 JMR谱数据表明该化合物含有一个典型的β-单取代呋喃环[δΗ6.28 (br，s，H-14)，7.38(br，s，H-15)4P7.35(br，s，H-16);SC128.9(C-13)，108.2(C-14)，144.0 (0-15)，和138.5((：-16)〕，一个酯羰基[6(：177.8((：-18)]，三个含氧次甲基[6072.1((：-3)， 84.6(06)，和70.6(012)]，连氧季碳[5073.2((：-8)]和两个甲基[5!11.21(3!1，8，!13-17)和 1.37 (3H，s，H3-19)]。根据它的分子式和NMR数据，该化合物鉴定为高含氧二萜类化合物。1H - 1H COSY谱表明C-I与C-4，C-6与C-7，C-11与C-12以及C-14与C-15具有相关性。HMBC谱中， H3-19与〇4，(：-5，(：-6，和(：-10以及出-17与(：-7，(：-8和(：-9的相关性表明化合物为含有5,8-二 甲基以及3,6,8_三含氧的六元二环双萜。HMBC谱中H-6与C-18以及H-3与C-18的相关性，表 明存在一个γ-内酯环。此外根据HMBC谱中H-12与C-14和C-16的相关性，可推断呋喃环位于 C-12位上。NOESY谱中Η3-19与Η-4，Η-6和H-IO相关性表明，它们均为α构型。Η-16和Η 3-17的相 关性表明CH3-17为β构型。此外，Η3-17与Η-20的相关性表明H-20、H-11和Η-7为β构型。此该化 合物结构如图1所示。
[0026]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0027] 一、材料和仪器
[0028] DMEM/F12高糖培养液购于北京Hyclone公司。改良型RPMI-1640培养基购于北京 Hyclone公司。标准胎牛血清购于天津TBD公司。CCK-8细胞活力检测试剂购于日本株式会社 同仁化学研究所。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于上海炎彬化工科技有限公司。Κ-? 线粒体膜电位探针购于江苏碧云天生物技术研究所。二甲基亚矾 (DMSO) 和磷酸盐缓冲溶 液(PBS)购于Sigma公司产品。
[0029] -70°C低温冰箱(Forma Scientif iclnc.公司，美国），电子天平（岛津AEL-200型， 日本），超净工作台（SW-CJ-IC型，苏州），恒温振荡器(THZ-C型，国产），高压蒸汽消毒锅 (YX-400B型，国产），C〇2细胞培养箱(FormaSeries Π ,ThermaleIectroncorp ·，美国），恒温 水浴锅（BHW2-1型，国产），倒置相差显微镜（CK40型，01ympus，日本），显