从万寿菊中提取6-羟基山萘酚单体化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种从万寿菊中提取6-羟基 山萘酚单体化合物的方法。
【背景技术】
[0002] 万寿菊，又名金菊花，学名Tagetes erecta，菊科万寿菊属，为一年生草本植物，除 具有观赏价值外，还具有很好的药用价值，如其根具有解毒消肿作用，用于治疗上呼吸道感 染、百日咳、支气管炎、口腔炎、乳腺炎等，其叶用于痈、疮、疖、疔，无名肿毒，其花平肝解热、 祛风化痰，用于治疗头晕目眩、头风眼痛、小儿惊风、感冒咳嗽、乳痛等症。但是目前的万寿 菊制剂成分一般为混合物，如将整朵万寿菊花风干后入药，缺乏必要的药效物质基础和药 效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。 可见，对万寿菊的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是针对以上现有问题，采用二维高效液相色谱的方 法，首次从万寿菊中分离纯化出6-羟基山萘酚，且纯度高达98%以上，为万寿菊及其制剂 的质量控制与临床合理用药提供了更为精准的指导依据。
[0004] 本发明所采用的技术方案为：
[0005] -种从万寿菊中提取6-羟基山萘酚单体化合物的方法，该方法包括以下步骤：
[0006] (1)以万寿菊干花为原料，干燥后磨成粉末状得到万寿菊粗粉，用乙醇浸泡或者回 流提取，然后过滤，取滤液重复1-3次，最终所得滤液进行旋转蒸发至干得粗提物，粗提物 再溶于甲醇-水二元混合溶剂中，进行减压抽滤，得到粗提物浓度为50-500mg/mL的提取 液；
[0007] (2)对提取液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为反相色谱柱DAISO C1S，采 用的流动相为A相水、B相甲醇的二元流动相，进样量为100-1000 μ L/针，连续进样，流 动相流速为6-16mL/min，洗脱方式为Β相浓度50-55% (即按体积百分比Β相50-55%、 A相45-50%混合而成的液体，下同理）等度洗脱20min，检测器为紫外检测器、检测波长 200-260nm，根据紫外吸收光谱收集13-18分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干， 得到一维液相组分；
[0008] (3)使用甲醇-水二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL ;
[0009] (4)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Acchrom X-Amide色谱柱，采用的流 动相为A相水、B相乙腈的二元流动相，进样量为10-500 μ L/针，连续进样，流动相流速为 2-4111171^11，洗脱方式为8相浓度80-90%等度洗脱20 1^11，检测器为紫外检测器、检测波长 200-260nm，根据紫外吸收光谱收集8-10分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得 到目的产物6-羟基山萘酚。
[0010] 作为优选，所述步骤（1)、（3)中甲醇-水二元混合溶剂中甲醇体积分数为 90-99 %，进一步优选为95 %。
[0011] 作为优选，所述步骤（2)中色谱柱的尺寸为直径20mm、长度250mm，其中填料粒径 为8 μπι，使用时柱温为室温或25-40°C，进一步优选为30°C。
[0012] 作为优选，所述步骤（2)中等度洗脱方式为B相浓度53%等度洗脱20min。
[0013] 作为优选，所述步骤（4)中色谱柱的尺寸为直径10mm、长度250mm，其中填料粒径 为8 μπι，使用时柱温为室温或25-40°C，进一步优选为30°C。
[0014] 作为优选，所述步骤（4)中洗脱方式为B相浓度85%等度洗脱20min。
[0015] 由于本发明原料万寿菊中的物质极性比较集中，所以我们选用二维高效液相色谱 进行有效组分的提取。
[0016] 在一维分离的条件选择上：首先，所分的样品量较大，所以挑选甲醇-水作为流 动相进行分离，既成本较低，又毒性较小，适合大规模生产所用；其次，在该样品中所含的 6-羟基山萘酚含量较大，C18柱可以对其进行分离，并结合甲醇-水流动相，可以在等度的 条件下就完成样品的一维分离，并得到较高的纯度，且柱残留较少；最后，通过对样品进行 梯度洗脱试验，我们发现样品中所含的物质极性较为相近，出峰时间集中，而采用本发明等 度洗脱的方式可以很好地完成初步分离，经过条件摸索发现53 %甲醇-47 %水是最佳的洗 脱条件，可以一维分离收集到最高纯度的6-羟基山萘酚，且与其他峰之间分离非常好，无 交叉或重叠等现象，非常有利于分离操作和后续进一步提纯，并且等度洗脱的方式利于开 展连续多次上样，既减少了色谱柱出峰的死时间，又节约了冲柱及平衡时间，可以在更短的 时间内完成6-羟基山萘酚的粗分离，适合于扩大到工业生产。
[0017] 在二维分离的条件选择上：首先，一维分离所得到的6-羟基山萘酚已具有较高的 纯度，且其中所含的杂质较少，但是这些杂质的极性与性质和6-羟基山萘酚极其接近，而 X-Amide柱具备将这些组分进行分离的能力，分离度好，选择性高，柱效高；其次，一维分离 所得样品量已经变少，使用乙腈-水来进行分离，可以使X-Amide柱更好地发挥作用；最后， 经过梯度洗脱试验，发现较好的洗脱条件为80-90%乙腈，而理论塔板数最高、出峰时间最 合适的是85%乙腈-15%水等度洗脱，这样的二维分离可以得到98%以上纯度的6-羟基山 萘酚。
[0018] 与现有技术中相比，本发明具有以下优点和显著效果：
[0019] (1)方法简单易行，可操作性强，仪器自动化程度高，常温常压下就可进行，重复性 好，得到的物质组分批次之间一致性高，经工艺放大后可以运用于工业生产；
[0020] (2)通过各工艺条件的良好协同作用和工艺参数的优化，可以分离得到纯度98% 以上的6-羟基山萘酚；
[0021 ] (3)重复性好，批次间一致性程度高，加上本发明万寿菊样品中物质极性比较集 中，适合采用连续进样的方式，不仅有效减少了柱洗脱时间，可以在更短的时间内完成万寿 菊中6-羟基山萘酚单体的制备，分离周期短，分离效率高，是一种缩短样品制备时间的的 理想方法；
[0022] (4)首次从万寿菊中提取得到6-羟基山萘酚，使万寿菊成为黄酮醇类药物的有效 组分原料，扩大了万寿菊的应用范围，有效提高了万寿菊的附加值；
[0023] (5)拓宽了 6-羟基山萘酚的原料来源，药材来源广，且得到的6-羟基山萘酚纯度 高，产量大，质量可控，可以使6-羟基山萘酚更好得发挥其抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、降 血脂、降血糖、免疫调节等作用，投入于相关药物的制备。
【附图说明】
[0024] 图1所示的是本发明实施例1从万寿菊中提取6-羟基山萘酚的一维高效液相色 谱图；
[0025] 图2所示的是本发明实施例1从万寿菊中提取6-羟基山萘酚的二维高效液相色 谱图；
[0026] 图3所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的分析型高效液相色谱图；
[0027] 图4所示的是本发明实施例1所得到的目的组分的核磁共振分析图，其中（a)为 1D1CNMR 谱（MeOD, 150MHz)的数据图谱，（b)为 1D13HNMR 谱（Me0D，600MHz)的数据图谱；
[0028] 图5所示的是本发明实施例2从万寿菊中分离纯化6-羟基山萘酚的一维高效液 相色谱图；
[0029] 图6所示的是本发明实施例2从万寿菊中分离纯化6-羟基山萘酚的二维高效液 相色谱图；
[0030] 图7所示的是本发明实施例3从万寿菊中分离纯化6-羟基山萘酚的一维高效液 相色谱图；
[0031] 图8所示的是本发明实施例3从万寿菊中分离纯化6-羟基山萘酚的二维高效液 相色谱图。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0033] 实施例1 :
[0034] 本实施例从万寿菊中提取6-羟基山萘酚单体化合物的方法，包括以下步骤：
[0035] 以万寿菊干花为原料，磨成粉末状后用乙醇提取旋蒸得到干燥的万寿菊粗粉 后称取5g，溶于50mL 95 %的甲醇-水溶液，制得万寿菊提取物溶液，浓度为100mg/mL， 过0.45 μπι微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用反相色谱柱DAIS0 C1S (250mmX 20mm i. d.，8 μ m)，流动相采用的为有机相与水相混合，其中Α相是水，Β相是甲 醇，等度洗脱方式：B相浓度53%等度2〇11^11。采用紫外检测器21〇11111和26〇11111为双选择吸收 波长，制备温度为室温，进样量为500 μ L/针，流动相流速为12mL/min，根据紫外吸收光谱 收集图1中5号峰（15-17分钟）作为目的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备6