065] 发酵结果:经84小时发酵后，产生丁醇12.38g/L，丁醇产率为13.9%。
[0066] 实施例5
[0067]海藻预处理糖化:将浓度为50g/L的泡叶藻匀浆液预处理后抽滤、离心固液分离， 取固体部分进行糖化，纤维素酶添加量为15FPU/g底物，酶解处理3天，酶解液使用抽滤、离 心固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半；
[0068]发酵培养基配制:待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料，加入硫酸铵直 至水解液中硫酸铵2.4g/L，加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L，1. lg/ L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3.0g/L，加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二氢钾 含量为1.2g/L，加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1. lg/L，加入硫酸镁直至水解液中硫 酸镁含量为〇. 4g/L，加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.02g/L，及加入硫酸铁直至水 解液中硫酸铁含量为0.02g/L，用氨水调节pH值为6.8，在121°C灭菌20分钟，制成发酵培养 基；
[0069]海藻水解液发酵:将配制好的培养基转入70L发酵罐中，培养基的装量为发酵罐体 积的60%，无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC 824,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程:首先在平板上挑 取Clostridium acetobutylicum ATCC 824,的单菌落接种到50mL液体RCM培养基中，并在 75 °C水浴中热激10分钟，然后37 °C厌氧培养；当菌体生长至0D600 = 0.8时，将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基中37°C厌氧培养作为种子液;当种子液菌体生长至0D600 = 0.2时，种子 液即成），种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10%，在40°C厌氧发酵84小时，即成。 [0070] 发酵结果:经96小时发酵后，产生丁醇6.62g/L，丁醇产率为16.5 %
[0071] 实施例6
[0072]海藻预处理糖化:将浓度为150g/L的巨藻匀浆液预处理后抽滤、离心固液分离，取 固体部分进行糖化，纤维素酶添加量为15FPU/g底物，酶解处理3天，酶解液使用抽滤、离心 固液分离后取液体部分减压蒸馏至原体积一半；
[0073]发酵培养基配制:待海藻水解液冷却到室温加入以此为主要原料，加入硫酸铵直 至水解液中硫酸铵10.8g/L，加入磷酸二氢钾直至水解液中磷酸二氢钾含量为5.0g/L， l.lg/L加入乙酸钠直至水解液中乙酸钠含量为3. Og/L，加入磷酸二氢钾至水解液中磷酸二 氢钾含量为1.2g/L，加入硫酸镁至水解液中硫酸镁含量为1. lg/L，加入硫酸镁直至水解液 中硫酸镁含量为〇. 4g/L，加入硫酸锰直至水解液中硫酸锰含量为0.02g/L，及加入硫酸铁直 至水解液中硫酸铁含量为0.02g/L，用氨水调节pH值为6.8，在121°C灭菌20分钟，制成发酵 培养基；
[0074]海藻水解液发酵:将配制好的培养基转入70L发酵罐中，培养基的装量为发酵罐体 积的75%，无菌操作接种预先培养好的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC 824,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(种子液的制作过程:首先在平板上挑 取Clostridium acetobutylicum ATCC 824,的单菌落接种到50mL液体RCM培养基中，并在 75 °C水浴中热激10分钟，然后37 °C厌氧培养；当菌体生长至0D600 = 0.8时，将50mL菌液转接 至5L液体CGM培养基中37°C厌氧培养作为种子液;当种子液菌体生长至0D600 = 0.2时，种子 液即成），种子液的接种量为发酵水解液培养基体积的10%，在37°C厌氧发酵72小时，即成。 [0075] 发酵结果:经72小时发酵后，产生丁醇23.28g/L，丁醇产率为17.2 %
[0076] 本实施例与实施例6的区别在于：所用发酵菌种为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCHMB 8052购自中国普通微生物菌种保藏管理中心）。
[0077] 发酵结果:经72小时发酵后，产生丁醇15.8g/L。
[0078] 实施例8
[0079] 本实施例与实施例6的区别在于：步骤（4)，所用发酵菌种为丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum ATCC 824,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心）和拜 氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心） 等体积混合物。
[0080] 发酵结果:经72小时发酵后，产生丁醇1.70g/L。
[0081] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
【主权项】
1. 一种生物丁醇的生产方法，其特征在于，以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培 养基，以接种发酵生产生物丁醇。2. 如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，以海藻为原料经预处理后用 于制备发酵培养基，在35-40°C下连续厌氧发酵72-120h以接种发酵生产生物丁醇，其中，菌 种种子液接种发酵培养基的量占发酵培养基总体积的6-12%。3. 如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，以海藻为原料经预处理后用 于制备发酵培养基，在37°C下连续厌氧发酵72h以接种发酵生产生物丁醇，其中，菌种种子 液接种发酵培养基的量占发酵培养基总体积的10%。4. 如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，所述海藻的含水量小于等于 2%〇5. 如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，还包括将发酵培养基以装量 为发酵罐体积的55-75 %加入发酵罐中进行连续厌氧发酵。6. 如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，所述海藻预处理的具体方法 包括以下步骤： 6.1) 将浓度为50-200g/L的海藻匀浆液固液分离后获得海藻，向海藻中加入纤维素酶 进行糖化处理3d获得酶解液，其中，纤维素酶的添加量为10-30FPU/g底物；以及 6.2) 将所述酶解液浓缩至原体积一半，用于制备发酵培养基。7. 如权利要求1所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基的具体配制 方法为，将预处理后的海藻冷却至室温，之后向其中依次加入硫酸铵磷酸、二氢钾、乙酸钠、 磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰和硫酸铁，使得发酵培养基中硫酸铵磷酸、二氢钾、乙酸钠、磷 酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰和硫酸铁的浓度分别为10-20g/L、2-10g/L、2-10g/L、l-1.5g/L、 1-1 · 5g/L、0 · 02-0 · 04g/L和 0 · 02-0 · 04g/L;之后，调节pH 值为 6 · 5-7 · 0，在115-121°C 下灭菌 15-30min，制得发酵培养基。8. 如权利要求2所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，所述菌种种子液的培养方法 为： 8.1) 将菌种接种到一级液体培养基中，之后将接种有菌种的一级液体培养基在75°C水 浴lOmin，之后将其至于37°C厌氧培养至一级液体培养基中的菌体生长至0D600 = 0.8时获 得一级菌液； 8.2) 将一级菌液转接至二级液体培养基中37°C厌氧培养至菌体生长至0D600 = 0.2时 停止发酵，获得菌种种子液； 其中，一级液体培养基与二级液体培养基的体积比为1:100。9. 如权利要求8所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，所述一级液体培养基为液体 RCM培养基，所述二级液体培养基为液体CGM培养基。10. 如权利要求1-9中任一项所述的生物丁醇的生产方法，其特征在于，所述菌种为丙 酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC 824或者拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052中的一种或者两种的等体积混合物。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种以海洋藻类为原料生产生物丁醇的方法，通过预处理糖化海藻，得到海藻水解液，以海藻水解液为原料生产生物丁醇的方法，该方法以海藻为原料经预处理后用于制备发酵培养基，在35-40℃下连续厌氧发酵72-120h以接种发酵生产生物丁醇。本发明方法与传统方法相比具有不与人争地、不与地争粮的优势；本发明方法中应用纤维素酶对海藻进行糖化预处理，破除了藻类细胞壁屏障，实现了对海藻细胞内多糖分解利用，并且通过本发明方法克服了海藻处理液中褐藻多酚等对菌体生长具有抑制作用，实现和提高了生物丁醇的高效产出，对促进海洋藻类生物丁醇生产的产业化发展、以及环境保护、粮食安全保障具有重要意义。
【IPC分类】C12P7/16, C12R1/145
【公开号】CN105603004
【申请号】CN201610046033
【发明人】叶乃好, 张晓雯, 徐东, 范晓
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月22日