经处理的滤器的制造方法
【专利说明】经处理的滤器
[0001] 相关申请
[0002] 该国际申请要求2013年10月7日提交的欧洲申请号13187628的优先权，其全文通 过引用纳入本文。 发明领域
[0003] 本发明设及一种过滤包含蛋白质的流体的方法。本发明还设及用于该方法的经处 理的滤器和由该方法得到的滤液。
【背景技术】
[0004] 在蛋白质物质的加工期间，通常需要使用过滤步骤。运一过滤步骤能够去除将对 最终产物不利的组分。例如，通过选择合适孔径的滤器，可能从病毒颗粒的大聚集体中分离 游离的、完整病毒颗粒。
[0005] EP0188104 Bl描述了通过装置如含有滤器的屯、切开术储器过滤血液产品。已经用 聚山梨醋80处理滤器，其改善了通过装置的血液的重力流。然而，该技术限于血液过滤并且 没有公开纯化治疗性蛋白质，如用于疫苗的病毒蛋白质或病毒粒子。EP0188104并没有使用 过滤来从感兴趣的蛋白质中去除大蛋白质聚集体。此外，EP0188104需要在使用之前干燥滤 器，运在本发明中不需要。
[0006] W0/2011/051235描述了加入叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRIT0NX-100⑥）W增加 流感疫苗制造中的过滤性能。然而，在W0/2011/051235中，曲通加入病毒制备物中而不是用 于预处理滤器。此外，在W0/2011/051235中，是在裂解之后和灭活之前加入。在本发明的情 况中，优选在裂解之前使用经去污剂处理的滤器。
【发明内容】
[0007] 在病毒产品的制备中，蛋白质物质的过滤、产物无菌性和安全性是关键的。采用灭 活步骤来杀死感染性物质。通常，灭活剂，如甲醒通过诱导蛋白质物质的交联来杀死感染性 复制机构，也可能产生聚集的蛋白质。已经发现过滤包含蛋白质物质的流体是远远不够的。 例如，尽管进行过滤和纯化步骤，仍观察到所需产品的量的明显减少，即使在预期蛋白质物 质的粒度容易通过滤器时亦是如此。
[000引发明人已经确定可通过在包含蛋白质物质的流体过滤之前或期间处理滤器来避 免感兴趣的生物产品（例如，蛋白质物质）的运种意料之外的损失。具体地，已经意外地发 现，与对照即其他等同条件下未处理的膜滤器相比，用表面活性剂预处理的膜滤器可导致 感兴趣的生物产品回收率得到令人惊讶的改善。
[0009] 因此，本发明提供了一种从包括大聚集体杂质的混合物中纯化生物产品，如蛋白 质的方法。按照本发明，生物产品经过滤通过具有截留大蛋白质聚集体杂质的尺寸的合适 过滤膜。用降低感兴趣的生物产品与滤膜的结合的表面活性剂预处理疏水性滤器。
[0010] 可通过本发明过滤的生物产品包括抗体、血液产品、病毒蛋白质和多糖。
【附图说明】
[0011] 图1显示了在过滤通过未处理的滤器之后流感病毒的各毒株的蛋白质损失百分 比。
[0012] 图2显示了正通过未处理的滤器的流感病毒的各毒株的流速与时间的变化。
[0013] 图3显示了在用未处理的滤器过滤之前和之后流感病毒毒株的粒度分布。
[0014] 图4显示了相对于用未处理的滤器过滤，按照本发明的处理滤器产生的回收病毒 产率的增加。
[0015] 图5显示了用各种憐酸盐缓冲盐水冲洗体积去除的聚山梨醋80(吐溫)的量。
[0016] 图6显示了相对于经聚山梨醋80(吐溫)处理的滤器，用经憐酸盐缓冲盐水溶液处 理的滤器过滤时病毒损失百分比。
【具体实施方式】
[0017] 在一个方面中，本发明设及从大蛋白质聚集形成的杂质中纯化感兴趣的生物产品 的方法。因此，在一些实施方式中，提供了含有至少一种感兴趣的生物产品的样品（例如，流 体)中去除聚集体的方法。
[0018] 按照本发明，该方法包括使用合适的膜滤器，该膜滤器已经用表面活性剂，例如表 面活性剂溶液预处理W提供经预处理的膜滤器。如本文中更详细的描述，经预处理的膜滤 器一般不在该步骤之后干燥。可任选地用合适的缓冲液或水洗涂经预处理的膜滤器W在过 滤步骤之前从膜滤器中去除过量(例如，未结合)的表面活性剂。一旦获得并任选地洗涂经 预处理的膜滤器，然后使用经预处理的膜滤器过滤含感兴趣的生物产品的样品（例如，流体 样品）。感兴趣的生物产品通过经预处理的膜滤器过滤并收集为滤液。该步骤从样品中去除 不需要的大聚集体。
[0019] 在一些实施方式中，提供了防止生物产品过滤期间损失的方法。减少制造期间产 品的不希望损失尤其对于生物产品而言是重要因素。可通过比较在过滤步骤之前样品中存 在的生物样品的起始量和在过滤步骤之后滤液中存在的生物产品的最终量来确定相对于 过滤的相对回收产率。希望该产率尽可能接近100%，例如，约100%、至少95%、至少90%、 至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%等。
[0020] 因此，本发明提供了方法，其中将包含第一量的生物产品的流体过滤通过经预处 理的膜滤器W回收滤液中的生物产品，其中滤液包含第二量的生物产品。在一些实施方式 中，第二量的生物产品是第一量的生物产品的至少7 5 %，例如，至少8 0 %、至少8 5 %、至少 90%、至少 95 %。
[0021] -般而言，在本发明的任意实施方式中，合适的膜滤器包括疏水性膜滤器。另外， 基于孔径选择合适的膜滤器W过滤感兴趣的生物产品同时截留流体样品中可能存在的聚 集体。如本文所示的数据所示，与未预处理的对照相比，可使用本文所述的方法实现滤液中 生物产品的明显更高的回收产率。
[0022] 本发明可用于加工包含一种或多种生物产品的组合物，具体用于需要高纯度的组 合物。因此，本发明可用于生产药品、营养品和/或化妆品。在一些实施方式中，生物产品是 或包括蛋白质、病毒样颗粒、病毒颗粒、病毒粒子、或其任意组合。
[0023] 在一些实施方式中，生物产品过滤通过一定孔径的疏水性滤膜，该孔径截留非感 兴趣产品的大蛋白质聚集体杂质，其中滤膜已经用去污剂预处理，并且预处理降低了感兴 趣的生物产品与滤膜的结合。该方法可包括其他步骤，尤其是将感兴趣的生物产品配制成 适用于给予人或动物患者的形式。
[0024] 在优选的实施方式中，感兴趣的生物产品是蛋白质。相对于感兴趣的生物产品的 尺寸/重量确定大蛋白质聚集体。大蛋白质聚集体理解为在尺寸和/或重量上明显大于感兴 趣的生物产品。明显大表示尺寸和/或重量比感兴趣的产物高至少8倍，优选10、15、20、30、 50倍。可通过，例如凝胶电泳确定蛋白质聚集体的尺寸和重量。如果病毒是感兴趣的产品， 则大聚集体的尺寸至少是化m，优选> 1.5; > 2、> 3、> 4、> 5、或> 10皿。如果是病毒蛋白 质，例如HA或NA抗原是感兴趣的产品，则大聚集体的尺寸是至少0.2皿，优选> 0.5、> 0.8、 > 1、含2、含3、含4、含5、或含lOiim。如果过滤的产物在尺寸/重量上不同于最终(治疗)产品， 例如，因为经过滤的产品经裂解、切割、标记等加工，则"感兴趣的产品"表示过滤步骤的产 品而非最终(经处理）的产品。
[0025] 在一个实施方式中，大蛋白质聚集体通过共价键连接，例如，通过甲醒交联。在另 一个实施方式中，大聚集体通过非共价键连接(例如，离子或疏水键）。蛋白质聚集体可能含 有非蛋白质组分，如核酸或糖。在优选的实施方式中，如果滤器材料还未如本发明所述经预 处理，则感兴趣的生物产品强烈结合滤器材料。运种结合在截留感兴趣的产物的完整性和/ 或生物功能的条件下甚至可能是不可逆的。
[0026] 因此，本发明的一个方面提供了一种将流体过滤通过滤器的方法，其中该流体包 含病毒蛋白质，尤其是流感抗原，并且该方法包括W下步骤：（i)将滤器与包含表面活性剂 的溶液接触W产生经处理的滤器，和（ii)使流体通过经处理的滤器W给出滤液。
[0027] 在优选的实施方式中，在步骤(ii)之前进行步骤(i)。或者，如下文所述，可同时进 行步骤(i)和(ii)。
[0028] 在另一个方面中，提供了一种过滤流体通过滤器的方法，其中该流体包含病毒或 病毒蛋白并且滤器已经与不同于包含表面活性剂的病毒制备物的溶液接触W产生经处理 的滤器并且该方法包括将流体通过经处理的滤器W得到滤液的步骤。产生的滤液可经进一 步加工如色谱纯化、深度过滤和/或灭菌W产生疫苗制剂。
[0029] 其他方法将是制备从鸡蛋或细胞培养物中培养的病毒蛋白质。可使用的制备技术 包括在培养的鸡蛋或细胞培养物中生长病毒，净化含有病毒的混合物W去除碎片，化学或 物理灭活混合物，过滤灭活的病毒通过已经用表面活性剂处理的滤器，然后进一步将病毒 加工成疫