一种竹叶石斛种子快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种竹叶石斛种子快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 竹叶石斛又名细叶石斛，学名Dendrobium hancockii Rolfe，是一种名贵中药，具 有养阴益胃、生津止渴等功效，药用价值和经济价值极高。
[0003] 此外，竹叶石斛的观赏价值极高，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被喻 为"四大观赏洋花"之一，即可作切花，也可盆栽观赏。
[0004] 竹叶石斛的种子非常细小，自然条件下极难萌发，而传统的分株繁殖和扦插繁殖 方法速度较慢，难于满足市场需求。采用植物组织培养技术是大量繁殖种苗的有效途径，但 是却未见有关竹叶石斛的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对上述不足，克服现有技术的缺陷，提供一种竹叶石斛种子 快速繁殖方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] -种竹叶石斛种子快速繁殖方法，包括预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分 化培养阶段和生根壮苗培养阶段;具体步骤如下：
[0008] 步骤（1)、预处理阶段:竹叶石斛的成熟果荚表面依次用75%酒精、O.lwt%升汞消 毒，再用无菌水处理，再将果荚浸入75%酒精，取出除去果荚表面水分，置于灭过菌的接种 盘中，切开果荚，取出种子；
[0009] 步骤(2)、种子萌发培养阶段:将种子接种于种子萌发培养基中萌发，培养温度为 25°C~27°C，光照强度为20001x~30001x，光照时间为12h/d;培养40d~50d得到原球茎;所 述的种子萌发培养基为1/2MS培养基；
[0010] 步骤(3 )、原球茎分化培养阶段:原球茎采用原球茎分化培养基进行培养，培养温 度为25°C~27°C，光照强度为20001x~30001x，光照时间为12h/d，培养50~60d使原球茎分 化出竹叶石斛小苗；
[0011] 步骤(4)、生根壮苗培养阶段:原球茎分化培养阶段得到的竹叶石斛小苗采用生根 壮苗培养基进行培养，培养温度为25°C~27°C，光照强度20001x~30001x，光照时间12h/d， 培养40d~50d得到组培苗。
[0012] 作为竹叶石斛种子快速繁殖方法进一步优选的技术方案，还包括炼苗移栽阶段： 培养在三角瓶中的组培苗在自然光条件下炼苗7d后，先半打开封口膜Id，再完全开瓶炼苗 2d;取出组培苗，用清水洗净组培苗根部残留的培养基，并用O.lmg/LNAA水溶液蘸根2~ 3min，然后移栽至木肩:草炭=3:1的基质中，根部封土，浇透水，罩上塑料膜进行保温保湿； 1周后，撤去塑料膜，并逐渐加大通风、增强光照，注意通风和温湿度的控制，湿度控制在75 ~90%，温度为20~28°(：。1个月后成活率高达90%，完成竹叶石斛种子快速繁殖。
[0013] 步骤⑴中，用75%酒精擦拭成熟果荚表面，然后用O.lwt%升汞处理lOmin，再用 无菌水处理3-5次;再将成熟果荚浸入75 %酒精中30s，取出用灭过菌的滤纸吸干果荚表面 的水分，置于灭过菌的接种盘中，冷却后切开果荚，取出种子。
[0014]步骤(3)中，所述的原球茎分化培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入6-BA(6-苄氨基腺嘌呤）和NAA(萘乙酸），其中6-BA的浓度为0.5~2.0mg/L，NAA的浓度为0.1~ 0.5mg/L，原球茎分化培养基的pH值为5.8-6.0;培养基配制完成后放入高温灭菌炉中121°C 灭菌20min。
[0015]作为优选，所述的原球茎分化培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为 0.2mg/L〇
[0016]步骤(4)中，所述的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入NAA，NAA的 浓度为〇. 1~I. 〇mg/L;生根壮苗培养基的pH值为5.8~6.0;培养基配制完成后放入高温灭 菌炉中121 °C灭菌20min。
[0017]作为优选，所述的生根壮苗培养基中NAA的浓度为0.1~0.7mg/L;作为进一步优 选，所述的生根壮苗培养基中NAA的浓度为0.7mg/L。
[0018] 作为另一个替代方案，所述的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入 IBA，IBA的浓度为0.1-1. Omg/L;生根壮苗培养基的pH值为5.8-6.0;培养基配制完成后放入 高温灭菌炉中121°C灭菌20min。优选的，所述的IBA的浓度为0.1mg/L。
[0019] 所述的组培苗的苗长为3cm以上，根数为2~3条，根系达1~2cm〇
[0020] 所述的1/2MS培养基的配置方法为，大量元素母液配制成50倍，其中CaCl2 · 2H20需 要单独配制置于另一小口瓶中；有机物质、微量元素及Fe盐母液分别配制成100倍，其中Fe 盐母液需放置在棕色瓶中保存;蔗糖的质量浓度为30g/L，琼脂的质量浓度7.0g/L;培养基 的pH 5.8-6.0,配制时根据配制的体积和浓缩的倍数量取所需量;配制完成后放入高温灭 菌炉中121°C灭菌20min，放在4°C低温冰箱中保存，保存期限最长1个月左右，如果母液中出 现絮状物质时，需重新配制。具体配置方式如表1所示：
[0021] 表1 1/2MS培养基配置表
[0023]本发明的有益效果：
[0024]本发明提供的竹叶石斛种子快速繁殖方法，是利用植物组织培养技术，将竹叶石 斛种子繁殖分为四个阶段，即预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分化培养阶段和生根 壮苗培养阶段四个阶段，考虑到不同阶段培养上的差异性，后三个阶段采用了不同的培养 基进行培养，1/2MS更好的满足了种子萌发、原球茎分化和生根壮苗阶段的营养需求，并且 结合每个阶段植物组织的成长，在原球茎分化培养阶段和生根壮苗中另外加入物质，来有 效调节植物组织的进一步生长。
[0025] 本发明提供的竹叶石斛种子快速繁殖方法，在种子萌发阶段，种子萌发率高达 95 %，45d即可出现大量原球茎;在原球茎分化阶段，分化出小苗的时间控制在60d以内，最 优可到50d;在生根壮苗培养阶段，45d左右组培苗长到3cm以上，根的条数为2条以上。从种 子萌发到无菌苗生根，达到炼苗移栽要求，这一周期的时间在150d左右，大大加快了竹叶石 斛种子繁殖速度，为竹叶石斛的快速生产提供了便利。
【具体实施方式】
[0026] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但 是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求 的限制。
[0027] 实施例1
[0028] 一种竹叶石斛种子快速繁殖方法，包括预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分 化培养阶段和生根壮苗培养阶段四个阶段，具体步骤如下：
[0029]步骤（1 )、预处理阶段，步骤如下：用75 %酒精擦拭成熟果荚表面，然后0.1 %升汞 处理IOmin，再用无菌水处理3次;将经前述处理的成熟果荚浸入75 %酒精中30s，取出用灭 过菌的滤纸吸干果荚表面的水分，置于灭过菌的接种盘中，冷却后切开果荚，取出种子； [0030]步骤(2)、种子萌发培养阶段:将种子均匀接种于种子萌发培养基中萌发，所述的 种子萌发培养基为1/2MS培养基;培养温度为25°C，光照强度为30001x，光照时间为12h/d; 培养45d后，出现大量直径l-3mm的原球茎；
[0031 ]步骤(3 )、原球茎分化培养阶段:原球茎采用原球茎分化培养基进行培养，所述的 原球茎分化培养基以1/2MS培养基为基础，加入6-BA和NAA，配制完成后放入高温灭菌炉中 121°C灭菌20min，培养基的pH为5.8;设置5组培养基处理，考察不同浓度6-BA和NAA对分化 培养的影响；
[0032] ①6-BA 1.0mg/L，NAA O.lmg/L;
[0033] ②6-BA 1.0mg/L，NAA 0.5mg/L;
[0034] ③6-BA 2.0mg/L，NAA 0.2mg/L;
[0035] ④6-BA 2.0mg/L，NAA 0.5mg/L;
[0036] ⑤6-BA 2.0mg/L;
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