一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一种含有萎缩芽孢萌发剂的萎缩芽孢 杆菌可湿性粉剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus、，非致病菌，枯草芽孢杆菌的一类变种，在 含有碳水化合物的培养基上可形成可溶的黑色菌落，主要从土壤中分离得到。在农业、工 业、科研、医疗和卫生等领域都有广泛的应用。萎缩芽孢杆菌能产生过氧化氢酶，不产生接 触酶，VP反应阳性，不产生硫化氢、吲哚以及二羟丙酮，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，能水解 淀粉和酪素。萎缩芽孢杆菌最适生长温度范围：28~30°C ;最大生长温度范围：50~55°C ;最小 生长温度范围：5~10°C。萎缩芽孢杆菌能在PH为4-9以及在7%NaCl中生长。萎缩芽孢杆菌能 利用L-阿拉伯糖、D-果糖、D-葡萄糖、甘露醇、水杨苷、蔗糖、海藻糖和木糖产酸不产气，不能 利用蜜二糖和乳糖发酵。罗华东等人筛选出对马铃薯甲虫具强致病性的细菌生防菌株萎缩 芽孢杆菌CPB072、CPB108,能降解几丁质、蛋白质，能利用蔗糖、甘露醇发酵，不能进行D-葡 萄糖发酵，CPB072能将硝酸盐还原成亚销酸盐，但是CPB108不能将硝酸盐还原成亚硝酸盐。
[0003] 1872年，由德国科学家Cohn建立的第一个细菌分类系统中，根据细菌形态特征建 立了芽孢杆菌属(BaciUus)。芽孢杆菌属细菌是一类能产球形或椭圆形芽孢的革兰氏阳性 菌，对干旱、紫外线、低温、高温等不良因子抗性强，分布广，存在于水、土壤、空气、植物以及 动物肠道中。同样，萎缩芽孢杆菌在环境中分布较广。韩松等人在铃铛刺花部器官中分离出 一株内生细菌HS-4，该菌最终确定为萎缩芽孢杆菌。薛鹏辑从平均海拔4000米以上的青藏 高原土样中分离到萎缩芽孢杆菌。Fall等人发现在植物根系中存在萎缩芽孢杆菌。
[0004] 生物防治(b i OI Og i Ca I contro 1)是利用生物种之间的相互关系，达到抑制另一种 或另一类有害生物的方法。微生物生防作用，作为生物防治的一种重要方法，也是一种可持 续控制病害的手段，备受关注。近来，人们从土壤和农作物内部分离出萎缩芽孢杆菌，逐渐 将其用于防治病害。
[0005] 吴忠红对具有耐盐促生和防病作用2株萎缩芽抱杆菌进行鉴定，并且研究其与其 它3株菌株混合培养以观察混合菌剂的防效作用。涂彩虹从土壤中分离纯化出一株具有黄 曲霄拮抗活性的萎缩芽孢杆菌，利用该菌株的发酵上清液观察抑制黄曲霉生长效果。
[0006] 石磊等通过平板透明圈法从大量生防菌中筛选获得一株具有几丁质酶活性的细 菌菌株CAB-I，该菌株对番茄灰霉病菌等多种植物病原真菌表现较强的拮抗活性。通过生理 生化、16S rDNA和gyrB基因序列测定，将菌株CAB-I鉴定为萎缩芽孢杆菌（Baci Ilus atrophaeus)。刘丁等从土壤中分离筛选的1株对黄曲霉具有诘抗作用的萎缩芽孢杆菌 (BaciUm atrophaeus、进一步深入研究。从营养竞争、直接寄生、诱导寄主抗性和抗生作用 多个方面探讨该株拮抗菌抑制黄曲霉的作用途径，通过营养竞争作用和诱导寄主抗性研究 发现，萎缩芽孢杆菌培养液无菌上清液中可能含有一种或几种萎缩芽孢杆菌的次级代谢产 物，具有拮抗黄曲霉的作用。
[0007] 目前芽孢杆菌作为生防制剂以可湿性粉剂为主，这种剂型虽然便于储存和运输， 但在生产应用中存在很多制约因子。如施用的可湿性粉剂中大部份以芽孢作为衡量产品中 有效成分的惟一标准，若芽孢不能及时萌发，施用效果则不佳，如王倩利用枯草芽孢杆菌 TR21防治巴西蕉枯萎病时，前期试验利用TR21菌株NB发酵液灌根和叶腋接种都能有效防治 枯萎病，但是利用芽孢制备可湿性粉剂的灌根与叶腋效果却不理想，验证了去掉发酵液后 的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下降。
[0008] 芽孢杆菌在自然界中分布广泛，当外部条件适合生长时，芽胞会由休眠状态经过 一系列复杂生理生化反应成长为营养体并恢复新陈代谢作用，这个过程称为萌发 (germination)。自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为"萌发 剂"，通常营养诱导芽孢萌发包括氨基酸、糖类和嘌吟核苷的单一作用，也包括它们的协同 作用（例如:AGFK; A: L-天冬酞胺;G:葡萄糖;F:果糖;K:钾离子）。当营养物质接触到芽孢 时，芽孢内部会发生一系列变化，（1 )、芽孢核内部H+和Zn2+释放出来，致使芽孢核内部pH由 弱酸性上升至弱碱性；（2)、芽孢核内部Ca 2+--DPA的大量释放；（3)、芽孢核水合，内部Ca2+--DPA被水所替代，芽孢的耐热性下降；（4)、芽孢皮层的芽孢肤聚糖层水解，芽孢核膨胀；（5)、 芽孢核进一步水合，芽孢核内部蛋白质流动性增强，酶活性加强，合成ATP; (6)、降解SASP蛋 白，以释放芽孢DNA，进而引导芽孢生长过程中RNA、蛋白质、DNA的合成。
[0009] 芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层 到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接 着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。
[0010] 现阶段，还未有在萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的技术方案公开，也未有在萎缩芽孢 杆菌可湿性粉剂中加入芽孢萌发剂的研究的报道。
[0011] 另外，由于不同的芽孢杆菌与湿润剂，分散剂等助剂的相容性，载体对各类芽孢杆 菌吸附性各不相同，将现有的芽孢杆菌可湿性粉剂的配方或制备工艺无法用于制备加入芽 孢萌发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂，可湿性粉剂中有效菌的吸附量，存活率，对有害菌的 防治效果及可湿性粉剂量的稳定性差异较大，其整个可湿性粉剂的制备方法必须全盘考虑 各载体吸附能力，对萎缩芽孢杆菌的干燥过程中保护作用，湿润剂，分散剂对可湿性粉剂的 悬浮率，湿润时间的影响，并且对芽孢萌发剂进行全面的筛选才能够得到湿润时间短，悬浮 率高，芽孢保存时间久，使用后芽孢能快速萌发的，防效好的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂。
【发明内容】
[0012] 本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种含有芽孢萌 发剂的萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法，芽孢萌发剂能使萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂 融入水后，萎缩芽孢能快速萌发，大大提高萎缩芽孢的萌发率，其制备的萎缩芽孢杆菌可湿 性粉剂芽孢含量为不低于100亿CFU/克，悬浮率不低于82%，润湿时间不高于75S，细度粉碎 过400目筛，水分含量不高于5%，制备方法稳定。
[0013] 为了达到上述目的，一种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成:萎缩芽孢 杆菌发酵液40-70份;填料：高岭土20-30份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂： Morwet D-425 0.2-1份;芽孢萌发剂：果糖0.1-1份，苏氨酸0.1-1份，2，6-吡啶二羧酸钙 0.1-0.5份;紫外保护剂:海藻糖1-2份，羧甲基纤维素0.2-1份;干燥保护剂:鹿糖1-5份，谷 氨酸钠0.2-1份。
[0014] -种萎缩芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成： 一、 萎缩芽孢杆菌发酵液的制备 取出菌种保藏管，用营养肉汤固体培养基划平板进行复苏，30°C培养48小时。在平板下 挑取单个菌落接种至50毫升营养肉汤培养基中，在培养箱中30°C震荡培养24小时。种子采 用5%的接种量，接种至5L大三角瓶中的萎缩芽孢杆菌液体培养基，装液量为2L，30°C震荡培 养16-28小时，检测其菌液浓度，菌液含量超过30亿/毫升，即可作为萎缩芽孢杆菌种子液； 将萎缩芽孢杆菌种子液接种至1000L的发酵罐中，装液量为600L的发酵培养基，通气量为前 16小时为每分钟液气比为1:0.8，其后通气量为1:1;培养温度前24小时为