Pin1 siRNA在制备治疗酒精性心肌病的靶向药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及PinlsiRNA的新医药用途，尤其涉及其在制备防治酒精性心肌病的靶向药物中的用途，属于酒精性心肌病的预防和治疗领域。
【背景技术】
[0002]到目前为止，心力衰竭仍然是一个重要的公共卫生问题。在美国，无论男性还是女性，长期大量饮酒被认为是非缺血性扩张型心肌病，即“酒精性心肌病”(ACM)的主要原因。通常，无症状的ACM，若每天饮酒量超过90克，时间在5年以上，则可能发展成有症状的ACM，以及出现心力衰竭的体征。
[0003]在无症状ACM阶段，通常表现为左心室扩张，左心室质量增加，左心室壁厚度降低或正常。病理学上，以前的研究显示ACM和心肌细胞凋亡之间有很强的相关性。在长期酗酒病人的心肌中，检测到心肌细胞凋亡以及BAX和BCL-2的表达。动物模型研究还表明，慢性酒精摄入可诱导氧化应激和心肌细胞凋亡。在原代心肌细胞培养模型，酒精被发现诱导活性氧介导的细胞凋亡，并在O-1OOmM的范围内呈剂量依赖性的方式。然而，酒精诱导心肌细胞凋亡的分子机制还有待进一步研究。
[0004]肽基脯氨酰顺-反异构酶(peptidyl-prolylcis/trans isomerase，Pinl)，是PPIase酶的parvulin家族中的一员，是能够异构化肽基-脯氨酰键特定的磷酸化丝氨酸/苏氨酸-Pro的基序，这可能会改变其活性，稳定性，磷酸化状态，和蛋白质-蛋白质相互作用。Pinl最初被认为是在酵母和人细胞中，细胞分裂所必需的。后来的研究表明，Pinl参与到许多其它细胞过程，如基因转录，细胞增殖，分化和凋亡中，并发挥重要的调控作用。另外，由于磷酸化蛋白是一个重要的信号传导机制，Pinl参与了 Ras信号通路和Wnt信号通路的激活。
[0005]在细胞凋亡的方面的调控，有研究证实，Pinl在肝癌细胞和结直肠癌SW620细胞中抑制了细胞凋亡。在本发明中，我们进一步研究了Pinl在高剂量酒精诱发的心肌细胞凋亡调节中的作用(图6所示)，并且发现，在原代小鼠心肌细胞中，酒精诱导Pinl表达和活化并以剂量依赖的方式存在。我们进一步证明PinlsiRNA使心肌细胞免受高剂量酒精诱导的凋亡，通过调节线粒体氧化应激和血管内皮型一氧化氮合酶(NOS)的表达发挥作用。
[0006]目前尚无针对酒精性心肌病的靶向药物。本发明的提出为酒精性心肌病的防治提供了新的技术手段。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是确定PinI s iRNA在酒精性心肌病发病机制中的作用，并将其作为一种新型的用于防治酒精性心肌病的靶向药物，应用于预防以及治疗酒精性心肌病之中。
[0008]为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段:
[0009]为了证明Pinl与酒精引起的心肌细胞凋亡的之间关系，本发明发明人通过将心肌细胞暴露于不同浓度的酒精(酒精分别为:0，50，100或200mM)后分析了Pinl表达。进一步的，本发明研究了过表达Pinl的心肌细胞以及Pinl敲低的心肌细胞对酒精介导的心肌细胞凋亡的抑制情况，并对过表达Pinl的心肌细胞以及Pinl敲低的心肌细胞中线粒体的氧化应激以及心肌细胞NO产生和eNOS表达进行了研究。以上研究结果显示Pinl参与了酒精引起的心肌细胞凋亡过程。高剂量的酒精刺激Pinl的表达和活性。PinlsiRNA介导的Pinl基因敲低可以明显抑制酒精介导的心肌细胞的凋亡，而Pinl的过表达则进一步增加凋亡的心肌细胞的数目。我们还进一步证明Pinl促进酒精介导的线粒体氧化应激以及线粒体膜电位的丢失，并抑制内皮型一氧化氮合酶的表达。而Pinl siRNA介导的Pinl基因敲低可以明显抑制酒精介导的线粒体氧化应激以及线粒体膜电位的丢失，NO的产生减少和eNOS的水平降低，从而进一步延缓了酒精性心肌病的发生发展进程。
[0010]因此，在上述研究的基础上，本发明提出了PinlsiRNA在制备治疗酒精性心肌病的靶向药物中的应用。
[0011]进一步的，本发明还提出了Pinl在作为靶点筛选治疗酒精性心肌病的靶向药物中的应用。所述的革E向药物能够抑制Pinl的表达。
[0012]本发明的提出为酒精性心肌病的防治提供了一种有效的技术手段。
【附图说明】
[0013]图1显示在酒精处理的心肌细胞中，Pinl的表达和活性上调；
[0014]不同浓度酒精(0，50，100，或200禮)处理心肌细胞24小时后:(&)91?1'-?0?方法测得PinlmRNA的表达；(b)ffestern blot方法检测Pinl的表达；(c)心肌细胞Pinl的活性测定;*P〈0.05和**P〈0.01与非酒精处理组比较；
[0015]图2显示Pinl敲除即PinlsiRNA抑制酒精介导的心肌细胞的凋亡；
[0016](a)PinlsiRNA转染后通过Western blot方法检测Pinl的蛋白表达；(b_d)PinlsiRNA转染后的心肌细胞，非酒精或酒精(200mM)处理24小时后测定:细胞的活性(b)，caspase-9和caspase-3活性(c)，TUNEL染色(d); *Ρ〈0.05、林P〈0.0I 和*林P〈0.001。
[0017]图3显示Pinl的过表达促进酒精介导的心肌细胞的凋亡；
[0018](a)Pinl质粒转染后通过Western blot方法检测Pinl的蛋白表达；(b_d)Pinl过表达的心肌细胞，非酒精或酒精(50mM)处理24小时后测定:细胞的活性(b)，caSpaSe-9和caspase-3活性(c)，TUNEL染色(d) o*P〈0.05、林P〈0.01 和*林P〈0.001 ；
[0019]图4显示Pinl增强酒精介导的心肌细胞线粒体氧化应激；
[0020]PinlPinlsiRNA转染后的心肌细胞中，分别在非酒精和200mM的酒精处理24小时后，Western blot方法检测细胞色素C衍生物(mCyt.C) (a)，线粒体膜电位(b)和线粒体活性氧(mROS)水平(c) Jinl过表达的心肌细胞，非酒精或酒精(50mM)处理24小时后测定:11^1(:((1)，线粒体膜电位(6)和线粒体活性氧(1111?03)水平(0。冲〈0.05，*扑〈0.01^111过表达的心肌细胞，酒精(50mM)、NAC(lyM)and ΜΗο_ΤΕΜΡ0(50μΜ)处理后测定:细胞活性(g)，0&8?386-3活性(10;朴〈0.05，*扑〈0.01与非酒精组比较。#?〈0.05与？丨111过表达的酒精组细胞比较；(i)非酒精或酒精(200mM)处理24小时后Western blot方法测定对照组和PinlsiRNA转染组的线粒体中p-p66Shc水平；(j)非酒精或酒精(50mM)处理24小时后Western blot方法测定Pinl过表达心肌细胞的线粒体中p-p66Shc水平；
[0021]图5显示酒精抑制Pinl降低心肌细胞NO产生和eNOS的水平;不同浓度酒精(O，50，100或200mM)处理心肌细胞24小时后:(a)N0产生水平、(b)Western blot方法检测eNOS表达的水平;PinlsiRNA转染后的心肌细胞中，分别在非酒精和200mM的酒精处理24小时后，(c)NO产生水平、(d)eNOS表达的水平;Pinl过表达的心肌细胞，非酒精或酒精(50mM)处理24小时后，(e)N0产生水平、(f)eNOS表达的水平;*P〈0.05和**P〈0.01。
[0022]图6为Pinl在酒精介导的心肌细胞凋亡过程的图示。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。这些实施例仅用于例证目的，绝不对本发明的范围构成任何限制。
[0024]实施例一:Pinl在酒精处理的心肌细胞中的表达和激活
[0025]首先使心肌细胞暴露于不同浓度的酒精(酒精分别为:0，50，100或200mM)后分析Pinl表达。如图la、b，从该结果可以看出乙醇可以促进Pinl的mRNA和蛋白水平升高，并呈剂量依赖性。此外，乙醇以剂量依赖的方式(图1 c)增加Pinl的活性。
[0026]实施例二:PinlsiRNA抑制酒精诱导的心肌细胞凋亡
[0027]方法:
[0028]1、细胞培养和细胞转染
[0029]分离出新生小鼠的心肌细胞。将心脏组织切碎并消化，沉降，除去成纤维细胞和内皮细胞，将心肌细胞培养于胶原涂布的培养皿中(每平方厘米约1.5 X 15个细胞)。PinlsiRNA(购自 Invitrogen(卡尔斯巴德))、Pinl质粒(购自 Addgene(剑桥))以及ScramblesiRNA使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)转染试剂转染。脂质体LipofectamineLTX(Invitrogen)根据说明书使用。心肌细胞(5 X 14细胞/孔)接种到24孔板，并生长过夜至约80%汇合。接着细胞用30皮摩尔siRNA或500纳克质粒共培养48小时，采用westernblot方法鉴定转染效率。
[0030]2、定量逆转录聚合酶链反应(定量RT-PCR)
[0031]使用TRIzoI试剂从心肌细胞中提取总RNA，使用方法依据说明书。使用superscript III第一链合成系统从I微克来自各样品的总RNA合成cDNAlinlmRNA的表达水平通过qRT-PCR测量，并使用2—""&方法计算，并且标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达。引物如下:
[0032]5，-CCGGAATTCATGGCGGACGAGGAGAAG-3，(正向)和
[0033]5，-TGCTCTAGATCATTCTGTGCGCAGGAT-3，(反向)，用于扩增Pinl ；
[0034]5，-TGG