7(d，J = 7.5Hz，lH)，7.59(m，lH)，7.50(m，2H)，7.44(dd，J = 7.5，1.4Hz， lH)，7.27(dd，J = 8.1，1.4Hz，lH)，7.16(t，J = 8.1Hz，lH)，7.04(d，J = 7.5Hz，lH)，6.87(dd， J = 7.4,5.0Hz,lH),4.55(t,J = 7.3Hz,2H) ,2.98( t,J = 6.3Hz,2H), 2.20(s,6H) ,1.27(s, 9H).
[0192] 实施例 20:l-(3-叔丁基苯基）-3-[4-[[2-[4-[2-(二乙基氨基）乙基]-4H-l，2,4-三唑-3-基]吡啶-4-基]氧基]-3-氟苯基]脲
[0193] ESI-MS m/z:546.1.
[0194] 实施例 21:l-(3-叔丁基苯基)-3-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基）丙基]-4H-l，2,4-三唑-3-基]吡啶-4-基]氧基]-3-氟苯基]脲
[0195] ESI-MS m/z:532.1.
[0196] 本发明产物的生物学活性研究
[0197] 本发明提供化合物抑制肿瘤细胞增殖活性研究：
[0198] 采用MTT法，对按照本发明的上式I的嘧啶类衍生物进行了体外抑制肺癌细胞 H460、结肠癌细胞HT-29及人乳腺癌细胞MDA-MB-231的活性筛选。具体操作为：
[0199] (1)细胞复苏并传代2-3次稳定后，用胰蛋白酶溶液(0.25% )使其从培养瓶底部消 化下来。将细胞消化液倒入离心管中后，之后加入培养液以终止消化。将离心管在800r/min 下离心10min，弃去上清液后加入5mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10yL细胞混悬液加入细胞 计数板中计数，调整细胞浓度为1〇 4个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加 入1 OOyL细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。
[0200] (2)用50yL二甲基亚砜溶解受试样品，然后加入适量培养液，使样品溶解成2mg/mL 药液，然后在24孔板中将样品稀释为20、4、0.8、0.16、0.032yg/mL。
[0201 ]每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只和为空白细胞 孔使用。将96孔板放入培养箱中培养72h。
[0202] (3)将96孔板中带药培养液弃去，用磷酸缓冲溶液(PBS)将细胞冲洗两遍，在每孔 中加入MTT(0.5mg/mL) 100yL放入培养箱中4h后，弃去MTT溶液，加入二甲基亚砜100yL。在磁 力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲臜充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过 Bliss法可求出药物IC5Q值。
[0203] 化合物抑制肺癌细胞H460、结肠癌细胞HT-29和人乳腺癌细胞MDA-MB-231的活性 结果见表1。
[0204]表 1
[0206] 从上述结果可以清楚的看出，本发明所要保护的式I的化合物可以显著抑制H460、 HT-29和MDA-MB-231细胞的增殖，部分化合物的生物活性优于上市药物索拉菲尼。
[0207] 本发明提供化合物抑制酪氨酸激酶的活性研究：
[0208] 采用Mobility shift测试法，对按照本发明的上式I的啼啶类衍生物进行了体外 抑制c-Kit、RET和FLT3激酶的活性筛选。具体操作为：
[0209] (1)以50mM HEPES(pH7,5)、0.0015%Brij-35、10mM MgCl2和2mM DTT配制IX的激 酶基础缓冲液；以lOOmM HEPES(pH7,5)、0.015%Brij-35、0.2%Coating Reagent、50mM Η)ΤΑ配制停止缓冲液。
[0210] (2)将测试激酶加入酶基础缓冲液中配制成2.5X的酶溶液;将FAM标记的肽和ATP 加入酶基础缓冲液中配制2.5X的肽溶液。
[0211] (3)以DMS0将测试化合物配制成0.5mM浓度的溶液，并根据测试浓度进行梯度的稀 释；将5yL测试化合物加入测试板中，加入10yL 2.5X酶溶液，并震荡lOmin，随后加入10yL 2.5X肽溶液，反应体系与28 °C培育lh;加入25yL的停止缓冲液中止反应。
[0212 ] (4)绘制抑制浓度曲线，计算I C5〇值。
[0213] 实施例化合物对c-Kit、RET和FLT3激酶的抑制数据见表2。
[0214] 表2
[0217] 从上述试验结果可以清楚的看出，本发明所要保护的通式I的化合物，具有良好的 体外抗肿瘤活性，相当或优于已上市的抗肿瘤药物索拉菲尼。
[0218] 实施例22:片剂
[0219] 用含有权利要求1中化合物的化合物（以实施例5化合物为例）10g，按照药剂学一 般压片法加辅料20g混匀后，压制成100片，每片重300mg。
[0220] 实施例23:胶囊剂
[0221] 用含有权利要求1中化合物的化合物（以实施例7化合物为例）10g，按照药剂学胶 囊剂的要求将辅料20g混匀后，装入空心胶囊，每个胶囊重300mg。
[0222] 实施例24:注射剂
[0223] 用含有权利要求1中化合物的化合物（以实施例1化合物为例）10g，按照药剂学常 规方法，进行活性炭吸附，经〇.65μπι微孔滤膜过滤后，填入氮气罐制成水针制剂，每只装 2mL，共灌装100瓶。
[0224] 尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的 技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。
【主权项】
1. 通式I的化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药， 其中，Y为H、面素； Ar为Cs-Cw芳基，并且Ar任选1-3个相同或不同的化取代； R3为H、径基、面素、（Ci-Cs)烷基、（Ci-Cs)烷氧基、被面代的（Ci-Cs)烷基或（Ci-Cs)烧氧 基； Ri和R2相同或不同，分别独立地选自（Ci-Cs)烷基、（Ci-Cs)烷氧基； 或Ri和R2与和它们所连接的氮原子一起形成5-6元饱和杂环基，所述饱和杂环基除了与 Ri和R2连接的氮原子外，任选含有1-4个选自N、0和S的杂原子，所述饱和杂环基任选被1-3个 相同或不同的R4取代； R4为H、（ Ci-Cs)烷基、（C广Cs)烷氧基、面素、径基； n为1-3之间的整数； "户"代表取代基连接处。2. 如权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药， 其中， Y为H、F。3. 如权利要求1或2所述的化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药， 其中， Ar为苯基、嗯挫基和化挫基，并且Ar任选1-3个相同或不同的化取代。4. 如权利要求1-3任何一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药，其 中， R3为H、面素、（C1-C4)烷基、（C广C4)烷氧基、被面代的（C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基，优选 为面素、叔下基、=氣甲基。5. 如权利要求1-4任何一项所述的化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药，其 中， 化和R2相同或不同，分别独立地选自甲基或乙基； 或Ri和R2与和它们所连接的氮原子一起形成4-吗嘟基、1-赃晚基、4-甲基-1-赃嗦基、1-赃嗦基、4-甲基-1 -赃晚基、1 -化咯烷基、4-硫代吗嘟基。6. 通式I的化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药，选自： 1-(4-氯-3-二氣甲基苯基)-3-[4-[ [2-[4-[2-(二甲基氨基）乙基]-4H-1,2,4-二挫-3- 基]化晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈； 1-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基）乙基]-4H-1，2,4-S挫-3-基]化晚-4-基]氧基]-3-氣 苯基]-3-(3-=氣甲基苯基)脈； 1-(3-氯-4-氣苯基)-3-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基）乙基]-4H-1，2,4-S 挫-3-基]化 晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈； 1-(4-氯-3-S 氣甲基苯基)-3-[4-[[2-[4-[2-(二乙基氨基）乙基]-4H-1，2,4-S 挫-3-基]化晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈； 1-[4-[[2-[4-[2-(二乙基氨基）乙基]-4H-1，2,4-S挫-3-基]化晚-4-基]氧基]-3-氣 苯基]-3-(3-=氣甲基苯基)脈； 1-(3-氯-4-氣苯基)-3-[4-[[2-[4-[2-(二乙基氨基）乙基]-4H-1，2,4-S 挫-3-基]化 晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈； 1-(4-氯-3-S 氣甲基苯基)-3-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基)丙基]-4H-1，2,4-S 挫-3-基]化晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈； 1-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基）丙基]-4H-1，2,4-S挫-3-基]化晚-4-基]氧基]-3-氣 苯基]-3-(3-=氣甲基苯基)脈； 1-(3-氯-4-氣苯基)-3-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基）丙基]-4H-1，2,4-S 挫-3-基]化 晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈； 1-(3,4-二氣苯基）-3-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基）丙基]-4H-1，2,4-S 挫-3-基]化 晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈； 1-(2,4-二氯苯基）-3-[4-[[2-[4-[2-(二甲基氨基）丙基]-4H-1，2,4-S 挫-3-基]化 晚-4-基]氧基]-3-氣苯基]脈。7. -种药用组合物，包含权利要求1-6中任何一项的化合物及其药学上可接受的盐、水 合物或前药作为活性成分W及药学上可接受的赋形剂。8. 权利要求1-6中任何一项的化合物及其药学上可接受的盐或权利要求7所述的药用 组合物在制备治疗和/或预防增生性疾病药物中的应用。9. 权利要求1-6中任何一项的化合物及其药学上可接受的盐或权利要求7所述的组合 物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的癌症为肺癌、结肠癌、肝癌、白血病 或、甲状腺癌。
【专利摘要】本发明涉及通式<b>Ⅰ</b>所示的吡啶类衍生物及它们药学上可接受的盐、水合物或前药，其中取代基Y、Ar、R1、R2具有在说明书中给出的含义。本发明还涉及通式<b>Ⅰ</b>的化合物具有抑制c-Kit、RET及FLT3激酶的作用，并且还涉及该类化合物及其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备治疗由于c-Kit、RET及FLT3等激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途，特别是在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。
【IPC分类】C07D401/04, A61P35/00, A61P35/02
【公开号】CN105646448
【申请号】
【发明人】秦铭泽, 宫平, 赵燕芳, 翟鑫, 刘亚靖
【申请人】沈阳药科大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月3日