一种高度氧化的二萜化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从泽漆的干燥全草中分离得到的一种具有心 肌保护作用的二萜化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 泽漆是大戟属(Euphorbia L.)植物泽漆Euphorbia helioscopia L.的干燥全草， 别名猫儿眼睛草、五凤灵芝等，分布于除新疆、西藏以外的全国各地。长期以来泽漆一直作 为民间草药，味苦，性微寒，有毒，归肺、小肠、大肠经。据《本草纲目》记载，泽漆有利水消肿、 消痰退热、散结杀虫等功效。临床用于治疗腹水、水肿、肺结核、颈淋巴结核、痰多喘咳、癣 疮。
[0003] 泽漆主要含二萜酯类、黄酮类化合物，是其主要的生物活性物质，另外还含有三 萜、甾醇、多酚类、氨基酸、天然油脂类化合物等多种成分。二萜酯类化合物是泽漆的主要有 效成分，主要分布于泽漆的乳汁中，根部也有分布。二萜酯类化合物对皮肤有刺激性，有辅 助抗癌的作用。
[0004] 现代药理研究表明泽漆具有抗肿瘤、抑菌、平喘止咳，抑制蘑菇酪氨酸酶活性等生 理活性。民间还用于治疗宫颈癌、食道癌等，并具有一定疗效，因此泽漆是一味很有研究开 发价值的药材。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从泽漆的干燥全草中分离得到的一种具有心肌保护作 用的二萜化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物(I)，
[0008]
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将泽漆的干燥全草粉碎，用 80~90 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和 的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙 酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用80%乙醇洗脱8个柱体 积，收集80 %乙醇洗脱液，减压浓缩得80 %乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中80 %乙醇洗脱浸 膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、35:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1、15:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反 相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液， 洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010]进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0011] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为85%。
[0012] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的载 体。该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对人和 动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选 自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重 服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口 服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口 服液等;用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0013] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。实验表 明：化合物（I)各给药组均能使心肌细胞存活率明显增加;在心肌细胞过氧化氢损伤培养液 中LDH的活性试验中，化合物⑴低、中、高剂量组、阳性药物组的LDH活性明显降低，表明化 合物(I)可以进一步研究开发成心肌细胞保护的药物。
【附图说明】
[0014] 图1为化合物(I)结构式；
[0015] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0017] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0018] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0019]制备方法：（a)将泽漆的干燥全草(8kg)粉碎，用85 %乙醇热回流提取(25L X 3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱和的 正丁醇（3LX 3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（359g)和正丁醇萃取物； (b) 步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱体积，再用 80%乙醇洗脱8个柱体积，收集80%乙醇洗脱液，减压浓缩得80%乙醇洗脱物浸膏（138g); (c) 步骤(b)中80%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积）、50:1 (8个柱体积）、35:1 (6个柱体积）、15:1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(32g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为 25:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3 个组分；（e)步骤(d)中组分2(17g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度 为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合 物（I)(29mg)。
[0020] 结构确证:册431]\^显示[]\1+他]+为111/2 369.1708，结合核磁特征可得分子式为 C20H26〇5，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d 6，600MHz): H-2 (3 · 57，m)，H-2 (3.42，m)，H-5(1.99，dd，J = 3.1，14.6)，H-6(2.51，dd，J = 3.1，14.6)，H-6(2.39，m)，H-ll (2.32，m)，H-ll(2.67，m)，H-12(1.57，m)，H-12(1.49，m)，H-14(4.24，s)，H-15(4.18，t，J= 7.8)，H-16(4.10，t，J = 7.8)，H-16(3.56，t，J = 7.8)，H-17(0.93，s)，H-18(0.97，s)，H-19 (1.01，8)，!1-20(1.21，8) ;核磁共振碳谱数据知(？?111，0150-(16，1501抱）：206.4((：，1-〇,52.2 (CH 2,2-C)，201.1(C，3-C)，44.7(C，4-C)，42.6(CH，5-C)，34.0(CH2,6-C)，198.8(C，7-C)， 128.9(C，8-C)，168.3(C，9-C)，44.5(C，10-C)，20.7(CH2，11-C)，21.9(CH2，12-C)，40.6(C， 13-C)，76.5(CH，14-C)，79.4(CH，15-C)，70.0(CH2，16-C)，17.9(CH3，17-C)，27.3(CH 3，18-〇,20.4(013，19-〇,21.8(013,2〇-〇;碳原子标记参见图1。红外光谱显示该化合物含有羟 基（3215cm-4和羰基（1687cm-4基团。4 NMR谱显示含有四个甲基信号SH0.93(s，H3-17)， 0.97(8，出-18)，1.01(8，出-19)以及1.21(8，出-20)。 130匪1?谱表明该化合物含有四个甲基， 五个亚甲基(一个含氧亚甲基SC70.0)，三个次甲基(两个含氧次甲基5〇76.5,79.4)，八个季 碳[包括三个羰基碳(叱206.4,201.1，198.8)，两个烯烃碳0(：128.9，168.3)]。上述数据表 明该化合物为高度氧化的二萜类化合物。HMBC谱中H 3-20与(：-1(60206.4)，出-18和出-19与 C-30C2O1.1)的相关性表明C-1和C-3为酮羰基。另外，H-5和H-14与C-7(SC198.8)的相关性 表明C-7亦为酮羰基。通过HMBC谱中H 2-6与C-8，H-14与C-8，H3-20与C-9的相关性C-8(S C128.9)和C-9(δ(：168.3)之间为双键。C-14位低场核磁碳信号（SC76.5)，再结合不饱和度推 测在C-14和C-160C7O.O)之间存在醚键。HMBC谱中Η-14与C-16;H-14与C-15;以及Η 2-16与 C-13的相关性验证了上述推测。N0ESY谱中H-14与H3-17;H-15与Η-12α;Η-15与H3-17的相关 性表明Η-14，Η-15和Η 3-17为β-构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关 类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值 与实验值基本一致(图2)。
[0021] 实施例2:化合物(I)药理作用试验
[0022] 一、材料和仪器
[0023]新生1~3天SD大鼠乳鼠（SPF级），雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供 (试验动物生产许可证:SCXK桂2009-0002)。化合物（I)(纯度2 98% )为自制。胎牛血清购于 Hy Clone公司，DMEM培养基购于GIB⑶公司，二甲基亚砜(DMS0)、0 · 25 %胰酶（含EDTA)购于 Solarbio公司，5-溴脱氧尿苷(5-Brdu)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Sigma公司，LDH测 试盒购于南京建成生物工程研究所，N0S试剂盒(分型）南京建成生物工程研究所，ATP酶试 剂盒(南京建成生物工程研究所），cTnI酶联免疫吸附测试试剂盒、CK-MB酶联免疫吸附测试 试剂盒购于武汉优尔生。
[0024] C02培养箱（Thermo Forma)，CKX41 相差显微镜（0LUMPUS)，Model 450 自动酶标仪 (美国Bio-Rad公司），96孔板(JET)，722sp可见分光光度计(上海棱光技术有限公司），可调 式微量移液器(Thermo Forma)，单人单面超净工作台（苏州净化设备总厂），XD-101型倒置 生物显微镜（南京江南光电），DW-40