一种抗原多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗原多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，甲型流感病毒属，一 般为球形，直径为80_120nm，其基因组为分8个节段的负链单股RNA，编码11个已知蛋白。其 中，病毒包膜上的糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是血清学区分多种病毒亚型的依 据，目前可分为16个Η亚型(H1~H16)和9个N亚型(N1~N9)。
[0003] 禽流感病毒可感染几乎所有野禽及家禽，根据致病力的不同，可将其分为高致病 性、低致病性和无致病性AIV。近年来，禽流感在世界范围流行，给养禽业造成巨大的经济损 失。由于是单链RNA病毒，所以禽流感病毒极易变异，除感染禽类外，还可感染人、猪、马、水 貂和海洋哺乳动物。1997年香港、2003年荷兰、2004年以来东南亚都出现了人感染高致病性 禽流感而死亡的病例。高致病性禽流感(Hihgly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)被世 界动物卫生组织(0ΙΕ)列为法定报告疫病，我国也将其列为一类动物疫病。
[0004] 2013年3月，我国首次出现Η7Ν9禽流感病毒感染人类，随后各地持续性出现感染病 例的报道，引起世界的广泛关注。一些研究认为这种新型禽流感病毒亚型Η7Ν9可能是一种 来自数种禽流感病毒的变异和重配病毒，从而赋予其跨越物种感染的能力。流感病毒血凝 素蛋白在病毒吸附、穿膜和决定病毒的致病性方面起着关键作用。血凝素变异性很强，近年 来已报道多起由禽流感病毒亚型Η7Ν1、Η7Ν2、Η7Ν3、Η7Ν4、Η7Ν7引起的禽流感爆发流行事件， 直接导致人类感染禽流感病毒数量的增加。
[0005] 研制快速诊断Η7亚型禽流感的检测方法，对于制定治疗和用药方案;控制传染病 流行具有重要的意义。通常情况下，高致病性禽流感的诊断可以根据临床症状、大体剖检等 作出初步诊断，具体可参考国家颁布的《高致病性禽流感防治技术规范》。确诊和分型则需 要进行实验室诊断，包括:病原的分离与鉴定、血清学诊断。实验室诊断Η7亚型禽流感患者 以反转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)为主，但是高致病性禽流感病毒需要在生物安全3级 实验室才能操作，操作人员必须经过专业的训练，而且分离鉴定需要较长的时间，因此该方 法的应用受到极大的限制。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种能够与人抗Η7亚型禽流感病毒血凝素抗体特异性结合的抗原 多肽，利用该抗原多肽制得的试剂盒可以快速、简便诊断人感染Η7亚型禽流感病毒。
[0007] -种抗原多肽，为如下(a)或(b)的蛋白质：
[0008] (a)氨基酸序列为QMTKSYKNTRKS的蛋白质；
[0009] (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸能够与人抗H7 亚型禽流感病毒血凝素抗体特异性结合的蛋白质。
[0010]所述抗原多肽是根据已报道的感染人的禽流感病毒A/Zhejiang/DTID-ZJUOl/ 2013(H7N9)株的血凝素蛋白（GenBank序列号AGJ51953.1)氨基酸序列，利用生物信息学和 免疫学技术预测并筛选出具有良好的特异性和较强的免疫原性的线性B细胞抗原表位。 [0011]本发明还提供了所述抗原多肽在制备诊断人感染H7亚型禽流感病毒的试剂盒中 的应用。
[0012] 由于本发明抗原多肽可以与抗H7亚型禽流感病毒血凝素抗体特异性结合，因此可 以利用免疫反应制得相应的试剂盒，如本发明实施例公开的多肽酶联免疫吸附试剂盒等， 当然也可以是试纸条。
[0013] 本发明又提供了一种诊断人感染H7亚型禽流感病毒的多肽酶联免疫吸附试剂盒， 包括预包酶标板，所述预包酶标板包被所述的抗原多肽。
[0014]优选的，所述抗原多肽使用浓度为10yg/mL，96孔酶标板每孔用量为lyg。抗原多肽 可以从公司购买人工合成的，也可以使用转基因技术由微生物细胞进行发酵获得。优选的， 抗原多肽为人工合成。
[0015] 除了上述预包酶标板外，该多肽酶联免疫吸附试剂盒还包括样品稀释液、阴性对 照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、TMB显色液和终止液。
[0016] 所述样品稀释液为牛血清白蛋白（BSA)浓度为5~50g/L的缓冲液;所述阴性对照 血清为未被H7N9感染的正常人血清；所述阳性对照血清为感染H7N9禽流感病毒的患者血 清;所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG抗体;所述浓缩洗涤液为25 X含Tween 20的缓冲液，使用时用纯净水稀释25倍，现配现用。
[0017] 本发明还提供所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0018] (1)样品收集、准备；（2)加样孵育；（3)洗板；（4)加二抗孵育；（5)洗板；（6)显色； (7)终止显色；（8)读板；（9)结果分析。
[0019]本发明结果分析的方法为：Cutoff = 2.1 X阴性对照孔平均值0D45Q，当待测样本 0D45Q 2 Cutoff值为阳性;样品0D45Q < Cutoff值为阴性。：
[0020] 本发明试剂盒检测灵敏度高、特异性强、成本低、方法简便、快速、重复性好，适用 于人感染H7亚型禽流感病毒的快速检测和流行病学研究，特别是能够适合于基层单位使 用。
【附图说明】
[0021] 图1为H7N9禽流感病毒血凝素蛋白线性抗原表位的预测结果图，其中A、B、C和D为 预测所得的4个抗原表位位点；
[0022]图2为预测的4段抗原多肽分别与流感病毒亚型H1~H16的HA蛋白氨基酸序列比对 图；
[0023]图3为预测的4个抗原表位位点在H7N9HA蛋白中的分布情况图；
[0024]图4为使用本发明试剂盒检测H7N9患者血清中血凝素特异性抗体的结果分析图。
【具体实施方式】 [0025] 实施例1
[0026] 通过DNAStar Lasergene's Protean系统分析人感染H7N9禽流感病毒血凝素蛋白 氨基酸序列(GenBank序列号AGJ51953.1)的抗原性、亲水性、柔韧性和表面可及性。选择抗 原性指数2 0、亲水性指数2 0、蛋白质表面可及性指数2 1和其内部或附近具有柔韧性结构 的氨基酸区段(图1)，综合分析以上结果，选取四种因素都符合的多肽区段判定为潜在的线 性B细胞抗原表位，共获得4段多肽，各预测位点分别位于其N端的第172-183(A)、363-380 (B)、452-472(C)和491-506(D)四个区段(表1)。
[0027] 表1预测人感染H7N9禽流感病毒HA蛋白线性B细胞抗原表位
[0028]
[0029] *是多肽序列每个氨基酸对应指数的加权平均值。