一种具有氧化-还原响应的透明质酸钠衍生物的制备方法
【专利说明】一种具有氧化-还原响应的透明质酸钠衍生物的制备方法
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技术领域
[0002]本发明涉及智能医用生物材料技术领域，是一种涉及一种透明质酸钠衍生物的制备方法，该透明质酸衍生物用于抗衰老、药物缓释、关节腔注射、注射美容等方面。
[0003]
【背景技术】
[0004]自由基学说(Free radical theory)是具有代表性的致衰学说之一。这一学说在20世纪50年代中期由著名学者HaMan首先提出，其后得到许多学者的共识。自由基是指独立存在的，含有I个或I个以上的不配对电子的任何原子或原子团，是机体正常代谢的中间产物，在机体内具有很强的氧化反应能力，且易产生连锁反应，对蛋白质、核酸、脂质等产生伤害，从而导致机体的损伤。大量的科学实验证实，氧自由基与机体损伤有着非常密切的关系。氧自由基是需氧生物细胞进行正常代谢的副产品。据统计机体每天吸入的氧气中有1%产生氧自由基。实验证明机体细胞存在少量氧自由基是维持生命所必需的，如甲状腺素的合成，必须有少量氧自由基的参与；嗜中性白细胞释放出的超氧阴离子及巨噬细胞产生的NO对杀灭外源细菌及体内坏死组织具有重要的意义。但氧自由基产生过多，或机体内的抗氧化自由基系统被大量消耗，氧自由基与抗氧自由基平衡失调时，自由基才便会引起疾病。大量的文献报道现有的诸多系统性疾病如风湿性骨关节炎、糖尿病、骨质疏松、白内障等均与氧自由基过多有密切的关系。
[0005]巯基化合物是一种具有较强还原性的活性化合物，在较低的氧化环境下即可发生反应，巯基自身氧化成二硫键化合物；而形成的二硫键在还原环境下，又可逆形成巯基。现在较常见的巯基化合物有半胱氨酸、谷胱甘肽(还原型)等。但是这类化合物均为小分子化合物，在体内易代谢，残存时间短。如何延长体内残存时间，更好地发挥巯基的抗氧化能力，是这类化合物用于抗氧化应用的关键。
[0006]透明质酸钠巯基化衍生物主要通过高分子与巯基乙酸、巯基乙醇、谷胱甘肽等含巯基基团的化合物之间发生接枝或交联反应制备而成。最常用的方法为碳二亚胺(EDC)活化羧基，进而接入巯基基团，但该方法接枝率低，对反应体系的PH依赖性高不利于产业化生产，同时由于巯基化合物花絮性质非常活泼，反应过程中极易引起巯基化合物的氧化，进而导致接枝率低；为改善上述弊端，大量的文献报道采用含二硫键的化合物进行接枝反应，然后通过二硫苏糖醇(DTT)将二硫键打断形成含有游离巯基的透明质酸衍生物，该方法解决了在接枝反应体系中巯基化合物易于氧化的弊端，但该方法首先需要在二硫键化合物的基础进行酰肼改性引入氨基，然后通过氨基与透明质酸中羧基之间的酰胺化反应形成目的产物，由此可见该种方法工艺繁琐，同时引入诸多的有机溶剂不利于后续的规模化放大及其生物相容性。
[0007]鉴于上述方法的不足，本发明采用吗啉衍生物作为偶联试剂进行制备透明质酸衍生物凝胶(以下简称DMTMM法)。DMTMM是目前较为理想的生成酰胺键的方法之一，其具有如下几个优势:1.反应活性高，单一氨基酸的接枝率可达到70%以上；2.反应温和，低温和室温下即可反应；3.对PH的依赖性弱，易于产业化生产；4.副反应少，未参加反应的吗啉衍生物不与透明质酸钠反应，且易于去除，有利于产品的质量控制。
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【发明内容】
[0009]本发明涉及了一种巯基化透明质酸衍生物的制备，得到的透明质酸巯基衍生物，可以对体内的氧化剂或自由基起到响应，起到抗衰老、抗氧化作用。
[0010]发明的具体内容如下:
本发明采用现在较为常用的偶联试剂4-(4，6- 二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，该偶联试剂具有反应活性高、低毒、易于去除等优点，主要用于活化羧基，进行酰胺键的合成制备。胱胺为有机二硫化合物，其分子的两端为氨基，均可以与羧酸形成酰胺键。
[0011]在偶联试剂DMTMM的作用下，胱胺与透明质酸钠的羧基端进行偶联反应，得到透明质酸钠衍生物，再通过二硫苏糖醇(DTT)还原，得到透明质酸的巯基衍生物。该衍生物在氧化剂存在下，有效地消除氧化剂，自身形成较好强度的水凝胶。
[0012]说明书附图
图1灭菌前后透明质酸钠衍生物巯基含量。
[0013]图2透明质酸钠衍生物对于自由基的消除作用。
[0014]图3透明质酸钠衍生物对于谷胱甘肽的感应曲线。
【具体实施方式】
[0015]现结合实施例，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0016]实施例一
将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为4，称取Ig透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并用盐酸将PH值调为4，然后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4°C下反应2天。
[0017]将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每Ih更换透析液I次并称重，直到凝胶质量不在增加时，终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，用IM的NaOH水溶液调节凝胶pH值为8~10，混合均匀后，加入二硫苏糖醇1.928g，室温下过夜反应，得到的反应液用盐酸溶液调节PH到3左右后，将溶液转移到透析袋中(截留分子量40000)，用ImM的盐酸和0.3M的氯化钠溶液透析2天，最后用ImM的盐酸透析I天。收集透析好的溶液并冷冻干燥，待用。
[0018]实施例二
将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为6，称取Ig透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并用盐酸将PH值调为6，然后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4°C下反应2天。
[0019]将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每Ih更换透析液I次并称重，直到凝胶质量不在增加时，终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，用IM的NaOH水溶液调节凝胶pH值为8~10，混合均匀后，加入二硫苏糖醇1.928g，室温下过夜反应，得到的反应液用盐酸溶液调节PH到3左右后，将溶液转移到透析袋中(截留分子量40000)，用ImM的盐酸和0.3M的氯化钠溶液透析2天，然后用ImM的盐酸透析I天。收集透析好的溶液并冷冻干燥，待用。
[0020]实施例三
将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为6.5，称取Ig透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并用盐酸将PH值调为6.5，然后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4°C下反应2天。
[0021]将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每Ih更换透析液I次并称重，直到凝胶质量不在增加时，终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，用IM的NaOH水溶液调节凝胶pH值为8~10，混合均匀后，加入二硫苏糖醇1.928g，室温下过夜反应，得到的反应液用盐酸溶液调节PH到3左右后，将溶液转移到透析袋中(截留分子量40000)，用ImM的盐酸和0.3M的氯化钠溶液透析2天，然后用ImM的盐酸透析I天。收集透析好的溶液并冷冻干燥，待用。
[0022]实施例四
将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7，称取Ig透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4°C过夜。第二天称取DMTMM 0.6918g用5mL水完全溶解并