一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于成体干细胞研究技术领域，更具体地，本发明涉及一种新生仔猪睾丸 生殖干细胞的高效获取方法。
【背景技术】
[0002] 雄性生殖干细胞(male germline stem cells，mGSCs)是一类存在雄性动物睾丸 中具有维持自我更新保持自身恒定和源源不断分化精子繁衍后代的干细胞。新生动物睾丸 组织内存在多种类型的细胞(生殖细胞、间质细胞、支持细胞、类肌细胞、血管和淋巴管上皮 细胞、血细胞和淋巴细胞），新生动物睾丸组织内多种细胞都呈现未分化的状态，相对集中 的呈现出各种具有干性的细胞，如mGSCs和间质干细胞(stem 1 eydig ce 11 s，SLCs)，这时还 并未出现分化的生殖细胞和间质细胞，这个时期对于富集mGSCs优于其他时期。
[0003]未成熟的支持细胞、类肌细胞、间质细胞和血管和淋巴管上皮细胞等成纤维样生 长的细胞，表现出增殖和贴壁能力强，利用体外差速贴壁法可以去除，Percoll密度梯度离 心的方法是有效的将淋巴细胞、血细胞和成体细胞分开的方法，这些分离措施虽然早已应 用到mGSCs分离中，但以往利用这些方法获取mGSCs的纯度并不高。
[0004] 对于传统分离方法，通过免疫学建立起来的免疫磁珠和流式分离方法，更多的应 用到成体干细胞分离中，但是一个目前主要的瓶颈是成体干细胞并未发现一种特异的分子 标记，特别是特异的膜表面标记，很多早先报道特异膜表面标记先后被证实并不呈现一种 特异的状态，早先证实GFRA1，THY-1和PGP9.5等一系列膜表面标记特异表达在mGSCs上，但 结果在使用这些膜表面分子标记分选人和家畜的mGSCs，却发现结果中的细胞存在大量的 间质细胞;证明了这些标记可能也表达在间质细胞上。目前，利用免疫学分离方法还并不能 有效的实现大动物和人的生殖干细胞的纯化。
[0005] 虽然mGSCs研究已开展多年，但是人和家畜mGSCs体外体系仍然未建立成功，目前 仅存在啮齿动物的mGSCs系，这和细胞纯度和生物性质等有直接关系。其中细胞纯度对于培 养和后期细胞生物学研究至关重要。成体干细胞数量少，分布广，分离难，是制约研究和应 用的主要问题。而人和家畜的mGSCs体系未建立成功，这和不完善的分离方法存在直接关 系。细胞系是研究细胞生物学性质和药物筛选的重要材料，获得高纯度单一种类细胞是建 立细胞系的首要基础。
【发明内容】
[0006] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新生仔猪睾丸生殖干 细胞的高效获取方法，该方法简化了操作步骤，优化了纯化效率，提高了重复性，提高了分 离细胞的纯度。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0008] (1)、通过胰蛋白酶和胶原蛋白的两步酶消化法获得新生仔猪的睾丸组织单细胞 悬液；
[0009] (2)、利用差速贴壁法将睾丸组织中贴壁能力强的成纤维类的细胞贴壁而被去除；
[0010] (3)、差速贴壁5次以后，基本都是不贴壁的细胞时，收集这些未贴壁细胞，所述未 贴壁细胞中含有淋巴细胞、红细胞和生殖干细胞；
[0011] (4)、利用Percoll密度梯度离心方法将密度不同的淋巴细胞和红细胞与生殖干细 胞分离，即得纯的生殖干细胞。
[0012]在其中一些实施例中，步骤（1)中所述胰蛋白酶的浓度为〇. 25wt%，所述胶原蛋白 酶的浓度lmg/mL。
[0013] 在其中一些实施例中，步骤(2)中所述差速贴壁法中所用的多聚赖氨酸的浓度为 0.1mg/ml，可以高效短时间的去除贴壁能力强的睾丸成纤维细胞。
[0014] 在其中一些实施例中，步骤(3)中所述差速贴壁的次数为5次，基本上去除掉了成 纤维类的贴壁细胞。
[0015] 在其中一些实施例中，步骤(4)中所述密度梯度离心方法为:配置20 %和40%两个 梯度的Percoll离心液，底层加入40 %Percoll液，上层加入20 %的Percoll液，离心后， mGSCs处于40%Perc〇ll液顶部，也就是20%的Percoll液底部，而红细胞离心后处于离心管 底部，淋巴和细胞碎片在20%P erc〇ll液面顶部，达到分离的目的。
[0016] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述睾丸组织为去掉了脂肪垫白膜和结缔组织 的睾丸组织。
[0017] 在其中一些实施例中，所述新生仔猪为1~5天的新生仔猪。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019] 1、本发明结合传统的差速贴壁法和密度梯度离心方法，摸索了不同时间点、处理 方法和浓度，通过大量试验和优化，将含有多种类型细胞的新生仔猪睾丸组织中的mGSCs分 离出来，在原有的分离方法基础上，优化建立起一套有效的新生仔猪mGSCs的分离纯化方 法，操作简单，重复性好，成功率高，对比以往的分离方法具有明显优势，这种方法获取的 mGSCs展现出形态均一，折光性好，流式检测结果显示纯度达到85%以上，达到了细胞培养 的要求，高效的获取高比例的mGSCs，对于后期研究mGSCs性质及其应用具有重要作用。
[0020] 2、本发明的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法不仅可应用于猪雄性生殖 干细胞生物学性质研究的科研平台、也可以在猪雄性生殖干细胞介导的动物育种、品种改 良和濒危品种保存等方面具有潜在的应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明实施例1的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法的路线图；
[0022] 图2是本发明实施例1的新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法的模式图；
[0023]图3是本发明实施例1中差速贴壁法获取高纯度mGSCs过程中的细胞状态图，其中， A:单细胞悬液;B:贴壁的成纤维样细胞;C:未贴壁的细胞;D:淋巴细胞和细胞碎片;E:红细 胞;F:纯化的生殖干细胞;G:碱性磷酸酶染色；
[0024] 图4为本发明实施例2中流式细胞术分析新分离mGSCs的纯度的分析结果；
[0025] 图5为本发明实施例3中对生殖干细胞的组织化学染色与免疫荧光检测结果图；其 中，A:纯化后猪mGSCs免疫荧光染色;B:原位组织化学染色；
[0026] 图6为本发明实施例4中对生殖干细胞的生殖标记检测和分析结果，其中，A:RT_ PCR检测;B:蛋白检测。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图和具体实施例来对本发明作进一步说明。
[0028]以下实施例中，0CT4(鼠源）、PGP9.5(兔源）和C-KIT(大鼠源）单克隆抗体购于 Mi 11 ipore公司；CD29 (鼠源）购于BD公司；GFRA1 (鼠源）、PLZF(鼠源）、LIN28 (兔源）和CD9〇 (鼠源）单克隆抗体购于Santa Cruz公司；NAN0G(兔源）单克隆抗体购于（cell signaling technology，CST)公司；（Alexa Fluor 568)焚光标记羊抗鼠二抗，（Alexa Fluor 568)焚光 标记羊抗兔二抗，（FITC)焚光标记羊抗鼠二抗购于Invitrogen公司；Hoechst 33342购于 Molecular Probes公司。其他原料均来源于市售。
[0029] 实施例1 一种新生仔猪睾丸生殖干细胞的高效获取方法
[0030] 请参阅图1和