水1:1稀释，然后沿管壁缓缓加入到3~5ml比重为 1 ·077±0 .OOlg/ml的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上，1500r/min离心15分钟，分离获取 外周血单个核细胞，用含10 %胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI1640培养基 (购自Gibco公司）悬浮细胞浓度为4X10 6/ml，移至六孔板中，2ml/孔，将六孔板放于37°C、 5 % C02培养箱中孵育2小时，去掉培养基及悬浮的细胞，在每孔中放入新鲜的RPMI1640培养 基，轻轻吹打，吹起壁上细胞，收集细胞悬液，即树突状细胞前体单个核细胞。
[0033] S2a、将树突状细胞前体单个核细胞诱导分化成未成熟树突状细胞；
[0034] 将步骤Sla中获得的细胞悬液转移到15ml离心管中，离心洗涤，计数细胞，使细胞 浓度达到2 X 106/ml，然后用完全培养基(含10 %胎牛血清RPMI1640)培养，并于培养当天加 入第一诱导剂，置于培养箱中培养6天，每隔3天更换新的培养基，并补充第一诱导剂，即可 收获未成熟树突状细胞；
[0035] 其中，第一诱导剂中包括：1000U/ml的rhGM-CSF、10ng/mL的GM-CSF、10ng/mL的IL-4，1000U/ml的rhIL-4和10ng/mL的IL-13。
[0036] S3a、诱导未成熟树突状细胞成熟；
[0037] 在树突状细胞前体单个核细胞培养的第6天，加入第二诱导剂培养3天至树突状细 胞成熟；
[0038] 其中，第二诱导剂中包括：1000U/ml的rhTNF-a、l〇μg/ml的没食子酸的浓度为，或 20^/πι1的核桃青皮提取物。
[0039] 实施例2
[0040] 与实施例1的不同之处在于，在本实施例中，
[0041] 所采用的第一诱导剂中，
[0042] rhGM-CSF 的浓度为800U/ml、
[0043] GM-CSF 的浓度为 5ng/mL、
[0044] IL-4 的浓度 5ng/mL、
[0045] rhIL-4 的浓度为800U/ml、
[0046] 和 IL-13 的浓度为 5ng/mL;
[0047] 第二诱导剂中，
[0048] rhTNF-α 的浓度为800U/ml、
[0049] 没食子酸的浓度为5μg/ml，
[0050] 或核桃青皮提取物的浓度为l〇μg/ml。
[0051 ] 实施例3
[0052]与实施例1的不同之处在于，在本实施例中，
[0053]所采用的第一诱导剂中，
[0054] rhGM-CSF 的浓度为 1200U/ml、
[0055] GM-CSF 的浓度为 15ng/mL、
[0056] IL-4 的浓度 15ng/mL、
[0057] rhIL-4 的浓度为 1200U/ml、
[0058] 和 IL-13 的浓度为 15ng/mL;
[0059] 第二诱导剂中，
[0060] rhTNF-a 的浓度为 1200U/ml、
[0061 ]没食子酸的浓度为15μg/ml，
[0062]或核桃青皮提取物的浓度为30μg/ml。
[0063]为进一步验证本发明提供的DC诱导活化剂及其应用具有显著的有益效果，设置以 下实验进行验证。
[0064] 检测组1~3-分别对应本发明实施例1~3所提供的成熟的树突状细胞；
[0065] 对照组一为采用现有方法获得的树突状细胞。
[0066] 1.细胞表型的FACS分析
[0067]分别收集检测组和对照组4组树突状细胞，加入PBS溶液悬浮细胞，调整细胞浓度 至为IX 106/ml，取100μΙ加入离心管，然后分别加入荧光标记抗体(抗⑶86、⑶11b、⑶11c及 I-Ab单抗)调整终浓度为5μg/ml，置4°C冰箱中，避光反应15min，添加 roS溶液洗涤2遍，以荧 光标记的同型Ig作为对照，上机(FACS calibur)检测细胞焚光强度，Cellquest软件分析。
[0068] 采用流式细胞术检测两组树突状细胞免疫分子表型荧光强度的比较(x±s)，检测 结果如下表1:
[0069] 表1 「00701
[0071] 检测结果:CD86含量高于CDllc和la说明树突状细胞表面共刺激分子活化T细胞的 第二信号CD86高表达，由表1数据可知，经本发明提供的DC诱导活化剂诱导所获得的成熟的 树突状细胞表面免疫分子活化T细胞的能力较强。
[0072] 2』1^六法测定细胞因子（几-10和11^-12?70)的含量
[0073]分别收集检测组1~3和对照组促成熟后的树突状细胞的上清液惊醒ELISA检测， 检测上清中IL-10与IL-12p70的分泌情况，检测数据见下表2，IL-10与IL-12p70的分泌水平 (x±s)，（单位:pg/ml)
[0074] 表 2
[0075]
L〇〇76J 检测结果：由表2数据扣知，检测组1-3中，树突状细胞分泌的IL-12p70的水肀远大 于IL-10,而IL-12p70能够直接作用CD8+T细胞使其增殖，增强细胞免疫效应以及形成长久 记性T淋巴细胞，能够分泌高水平的IL12是树突状细胞生物活性高的标志之一；由此可知， 通过本发明提供的DC诱导活化剂所获得的树突状细胞生物活性优于对照组通过现有技术 所获的树突状细胞的生物活性。
[0077] 3. CCK-8法抗原肽特异性T细胞的增殖反应
[0078] 分别对检测组1~3和对照组细胞执行以下操作：
[0079] 将抗原肽负载并促成熟后的树突状细胞与T细胞以细胞数1:10的比率共培养5天 后，用CCK法检测T细胞的增殖情况。
[0080] 表3为检测组和对照组影响T细胞增殖反应的比较（％，x土s)
[0081]
[0082] 检测结果:树突状细胞作为抗原呈递细胞的一个重要的功能是刺激T细胞增殖，因 此，树突状细胞能否激活细胞毒性T淋巴细胞是检验树突状细胞功能的关键问题。由表3中 数据可知，通过本发明提供的DC诱导活化剂所获得的树突状细胞能够促进并提高T细胞的 增值率，增强免疫反应能力。
[0083] 以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方 式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发 明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这 些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种DC诱导活化剂，其特征在于，包括rhTNF-α和，没食子酸或核桃青皮提取物。2. 根据权利要求1所述的DC诱导活化剂，其特征在于，所述rhTNF-α的浓度为800~ 1200U/ml和，没食子酸的浓度为5~15μg/ml或所述核桃青皮提取物的浓度为10~30μg/ml。3. 根据权利要求2所述的DC诱导活化剂，其特征在于，所述rhTNF-a的浓度为l〇〇〇U/ml 和、没食子酸的浓度为l〇μg/ml或所述核桃青皮提取物的浓度为20μg/ml。4. 根据权利要求2所述的DC诱导活化剂，其特征在于，所述rhTNF-a的浓度为800U/ml 和、没食子酸的浓度为5μg/ml或所述核桃青皮提取物的浓度为10μg/ml。5. 根据权利要求2所述的DC诱导活化剂，其特征在于，所述rhTNF-a的浓度为1200U/ml 和、没食子酸的浓度为15μg/ml或所述核桃青皮提取物的浓度为30μg/ml。6. 根据权利要求1~5任一项所述的DC诱导活化剂，在诱导DC成熟过程中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种DC诱导活化剂，包括rhTNF-α、没食子酸或核桃青皮提取物。本发明进一步涉及由上述DC诱导活化剂在诱导DC成熟过程中的应用。与现有技术相比，本发明提供的DC诱导活化剂能够提高树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞细胞的增值率及成熟率，进而提高树突状细胞的抗原提呈性。
【IPC分类】C12N5/0784
【公开号】CN105647866
【申请号】
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月28日