诱导树突状细胞成熟的方法和树突状细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种诱导树突状细胞成熟的方法和树突状细 胞。
【背景技术】
[0002] 细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传 统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有 发展前途的一种治疗手段，也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。
[0003] 细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增 多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变 的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。目前在 临床中使用最多的细胞免疫治疗疗法主要是DC治疗、CIK治疗和DC-CIK联合免疫治疗。
[0004] DC是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)， 一方面，其能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答;另一方面，树突状细胞还能够呈递抗 原给MHC-I类限制性CD8+和MHC-II类限制性CD4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为 "天然免疫佐剂"，因此，树突状细胞在诱导免疫应答中具有独特的地位。
[0005] 近年来，以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的肿瘤免疫治疗及DC疫苗已 取得较大进展，体外制备的DC疫苗显示出明显诱发抗肿瘤免疫应答的能力，具有良好的临 床应用前景。目前，从外周血单个核细胞(PBMC)经GM-CSF、IL-4体外诱导培养DC的方法已基 本得到公认，但DC体外促成熟的方案尚没有统一的标准，国内主要采用TNF-a因子，但该方 法活化的DC成熟度低下，不能分泌促炎因子IL-12,致使培养得到的DC功能缺陷，很大程度 上限制了DC疫苗的临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步 完善，以有效提高DC疫苗在诱导抗炎或抗肿瘤免疫应答中的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术培养出的树突状细胞体外诱导成熟 率低，细胞增殖率低，且抗原提呈性能差等缺陷，提供一种能够提高树突状细胞成熟率及抗 原提呈性能的诱导树突状细胞成熟的方法。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种诱导树突状细胞成熟的方 法，包括以下步骤：
[0008] 获取树突状细胞前体单个核细胞，经第一诱导剂培养4~7天，每隔2~3天更换培 养基，获得未成熟树突状细胞；
[0009] 然后，再添加第二诱导剂培养所述未成熟树突状细胞2~4天至树突状细胞成熟；
[0010] 其中，第一诱导剂包括:rhGM-CSF、GM-CSF、IL-4、rhIL-4和IL-13;
[0011] 第二诱导剂包括rhTNF-α、没食子酸或核桃青皮提取物。
[0012] 在本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法中，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的 浓度为 800 ~1200U/ml、GM-CSF 的浓度为 5 ~15ng/mL、IL-4 的浓度为 5 ~15ng/mL、rhIL-4 的 浓度为800~1200U/ml和IL-13的浓度为5~15ng/mL。
[0013] 在本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法中，所述第一诱导剂中，rhGM-CSF的 浓度为 l〇〇〇U/ml、GM-CSF 的浓度为 10ng/mL、IL-4 的浓度为 10ng/mL、rhIL-4 的浓度为 1000U/ ml和IL-13的浓度为10ng/mL。
[0014] 在本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法中，所述第二诱导剂中，rhTNF-α的浓 度为800~1200U/ml、没食子酸5~15μg/ml，或核桃青皮提取物的浓度为10~30μg/ml。 [0015]在本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法中，所述第二诱导剂中，rhTNF-a的浓 度为1000U/ml、没食子酸10μg/ml，或核桃青皮提取物的浓度为20μg/ml。
[0016] 在本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法中，所述树突状细胞前体单个核细胞 来源于外周血。
[0017] 在本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法中，所述树突状细胞前体单个核细胞 的获取过程，包括以下步骤：
[0018] 抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10~20分钟后，分离获取外周血 单个核细胞;用完全培养基悬浮细胞浓度至(2~6) X 106个/ml，孵育1~3小时，更换新的完 全培养基，收集细胞悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。
[0019] 在本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法中，所述完全培养基中含有10%~ 15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml链霉素。在本发明提供的诱导树突状 细胞成熟的方法中，还包括以下步骤:添加所述第一诱导剂之前，需调节所述树突状细胞前 体单个核细胞浓度为(1~3) X106个/ml。
[0020] 本发明还提供一种树突状细胞，是由上述诱导树突状细胞成熟的方法所获得的。
[0021] 实施本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法，可以达到以下有益效果：与现有 培养树突状细胞的方式相比，本发明通过第一诱导剂和第二诱导剂对树突状细胞进行两个 阶段的诱导活化，促进提高树突状细胞的细胞活性，提高树突状细胞的增值率及成熟率，进 而提尚树突状细胞的抗原提呈性。
【具体实施方式】
[0022] 本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法，包括以下步骤：
[0023] S1、获取树突状细胞前体单个核细胞；
[0024] S2、采用第一诱导剂将树突状前体细胞当个核细胞诱导分化成未成熟树突状细 胞；
[0025] S3、采用第二诱导剂将未成熟树突状细胞诱导分化成成熟的树突状细胞。
[0026] 具体地，步骤S1中，优选地，树突状细胞前体单个核细胞来源于新鲜外周血，相比 经过冷库储存或者培养传代之后的树突状细胞，从新鲜血液中制备的树突状细胞前体单个 核细胞离体时间较短，其细胞活性和状态的减弱或者形态改变程度都较少，更加利于保持 其免疫性能。在本发明中，树突状细胞前体单个核细胞的具体获取过程为：
[0027]抽取外周静脉血，稀释，添加淋巴细胞分离液离心10~20分钟后，分离获取外周血 单个核细胞；
[0028] 用含有10%~15%的胎牛血清、50~150U/ml青霉素和50~150U/ml链霉素的完全 培养基悬浮细胞浓度至(2~6) X106个/ml，孵育1~3小时，更换新的完全培养基，收集细胞 悬液，即为树突状细胞前体单个核细胞悬液。
[0029]步骤S2的具体过程为：
[0030] 取步骤S1获得的树突状细胞前体单个核细胞悬液，离心洗涤后计数，使细胞浓度 达到（1~3) X106个/ml，用完全培养基培养，并与培养当天添加第一诱导剂，培养4~7天， 每隔2~3天更换培养基。
[0031] 其中，第一诱导剂包括rhGM_CSF(Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，重组人粒-巨细胞集落刺激因子）、GM_CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，粒-巨细胞集落刺激因子）、IL_4( Interleukin 4,白细胞介素 4)、rhIL_4(Recombinant human interleukin 4,重组人白细胞介素 4)和IL-13(Interleukin 13,白细胞介素 13);其中，rhGM-CSF的终浓度为800~1200U/ml、GM-CSF的 终浓度为5~15ng/mL、IL-4的终浓度为5~15ng/mL、rhIL-4的终浓度为800~1200U/ml和 IL-13的终浓度为IL-13的浓度为5~15ng/mL。
[0032] 第一诱导剂所含成分能够诱导树突状细胞前体单个核细胞转化为未成熟的树突 状细胞，增大细胞体积，并促进细胞的生长增殖和分化，促进细胞形成集落；同时，对已分化 的未成熟树突状细胞进行预刺激，使未成熟树突状细胞能够快速成熟。
[0033] 步骤S3的具体过程为：
[0034] 向步骤S2a获得的未成熟树突状细胞中添加第二诱导剂培养2~4天至未成熟的树 突状细胞全部成熟；其中，第二诱导剂包括rhTNF_a(Recombinant human tumor necrosis factor-α，重组人肿瘤坏死因子α)、没食子酸或核桃青皮提取物;且rhTNF-α的终浓度为800 ~1200U/ml、没食子酸的终浓度为5~15μg/ml或核桃青皮提取物的终浓度为核桃青皮提取 物的浓度为10~30μg/ml。
[0035] 其中，rhTNF-α能够刺激树突状细胞成熟，以提高树突状细胞抗原提呈能力。而核 桃青皮提取物的主要成份包括没食子酸、甲醇、石油醚、氯仿、正丁醇等，对金黄色葡萄球菌 等细菌具有强抗菌作用，并且对真菌也有明显抑制作用；另外，还能够清除自由基，具有较 强的抗氧化活性，以提高树突状细胞的细胞活性，促进其成熟和正常的生长增殖。
[0036] 基于本发明的上述诱导树突状细胞成熟的方法，本发明还提出一种由上述方法制 备得到的树突状细胞。
[0037] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
[0038] 实施例1
[0039] 本发明提供的诱导树突状细胞成熟的方法，包括以下步骤：
[0040] Sla、获取树突状细胞前体单个核细胞；
[0041]抽取外周静脉血3-5ml，生理盐水1:1稀释，然后沿管壁缓缓加入到3~5ml比重为 1 ·077±0 .OOlg/ml的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上，1500r/min离心15分钟，分离获取 外周血单个核细胞，用含10 %胎牛血清、100