诺如病毒的逆转录环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诺如病毒的逆转录环介导等温扩增检测 引物组、检测方法和试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 诺如病毒感染性腹泻具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌 性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物 品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。不 同地区、不同时间流行的诺如病毒，其基因 RNA多聚酶区序列相对保守。根据RNA多聚酶区核 苷酸序列的相似性，诺如病毒被分为5个基因群(genogroup)。同一基因群内的诺如病毒，其 主要衣壳蛋白（major capsid protein)氨基酸序列的异质性约为30%，但不同基因群间的 诺如病毒，其主要衣壳蛋白（major capsid protein)氨基酸序列的异质性超过50%。目前 已知，感染人类的诺如病毒至少包括基因 I群、Π 群和IV群。诺如病毒对各种理化因素有较 强的抗性，已知其耐热和耐冻，60 °C孵育30min仍有感染性，冷冻数年后仍保持活性;对乙醚 和酸稳定，20%乙醚4°C处理可存活18h，室温pH2.7环境下可存活3h。诺如病毒对处理污水 的1 Oppm的氯浓度敏感，但对处理饮用水的3.7 5~6.25ppm的氯浓度耐受。此外，诺如病毒的 感染剂量很低，10-100个病毒粒子即可使人致病，而且诺如病毒常呈暴发流行，因此，即使 环境中存在的微量病毒，仍然对人得健康存在很大威胁。
[0003] 诺如病毒遗传高度变异，在同一时期和同一社区内可能存在遗传特性不同的毒株 流行。诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感 染。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成 人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90%是由 诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在发展中国家，诺 如病毒感染性腹泻普遍存在，也常引起暴发流行。在我国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检 出率为15%左右，血清抗体水平调查表明我国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。
[0004] 目前诺如病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分 子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的 仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等 实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通 量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测 到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非 特异性出现等缺陷。LAMP方法是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测 靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65°C左右等温条件 lh内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到109拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀 或者加入显色剂进行判断。近年来LAMP方法已广泛用于细菌、病毒等致病微生物的检测，并 在此基础上发展了 RT-LAMP检测方法，成功应用于多种RNA病毒的检测。
【发明内容】
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[0005] 本发明的第一目的是提供一种应用逆转录环介导等温扩增检测诺如病毒 (norovirus)的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测诺如病毒(norovirus)。
[0006] -种应用逆转录环介导等温扩增检测诺如病毒的检测引物组，其特征在于，由下 列引物组成：
[0007] 上游外引物F3:5'-GATGGGTCCRCAGCCAAC-3'；（其序列如SEQIDN0.1所示）
[0008]下游外引物B3:5'-TCARATCAGGGCCYAAGG-3'；（其序列如SEQIDN0.2所示）
[0009] 上游内引物FIP: 5 ' -GCTACAGGYGCCGCRATAGCGGATCCCCCAGAGGTCAACAATGAGG-3 ' ； (其序列如SEQ ID NO.3所示）
[0010] 下游内引物BIP: 5 ' -TACAAGCCCCTGGTGGAGAGTCGATCCCGCGCTCCAYAGTATYTCAC-3'；（其序列如SEQ ID N0.4所示）
[0011] 所述的 R为 A/G，Y为 C/T。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的诺如病毒的检测方 法，其特征在于，对样品进行病毒RNA提取，得到RNA样品，然后通过逆转录环介导等温扩增 的方法用所述的检测引物组对RNA样品进行扩增，确认是否存在有扩增产物。
[0013] 优选，所述的样品为医院的腹泻样品，水或食品。
[0014] 优选，所述的通过逆转录环介导等温扩增的方法用所述的检测引物组对RNA样品 进行扩增具体为:环介导等温扩增体系为：1〇\131^€612.5以1^、1〇111]\1(1阶？8 3以1^、1(^]\1?1? 2μL、10μΜ ΒΙΡ 0·5μL、10μΜ F3 0·5μL、10μΜ B3 2yL、25mM MgS〇4 2yL、0.4M Betaine 2·5μ L、Bst DNA聚合酶lyL、AMV逆转录酶0.25yL、RNAlyL，去离子水补足至25yL，反应条件为:64 °C 孵育 40min。
[0015] 优选，所述的确认是否存在有扩增产物是在终止反应的反应管中加入lyL 10% SYBR GreenI显色剂，10min后观察结果，如果颜色为黄色，则样品诺如病毒阴性，无诺如病 毒，如果颜色为绿色，则样品诺如病毒阳性，含有诺如病毒。
[0016] 本发明的第三个目的是提供一种诺如病毒的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，逆转 录环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：
[0017] 上游外引物F3:5 ' -GATGGGTCCRCAGCCAAC-3 ' ；
[0018] 下游外引物B3:5 ' -TCARATCAGGGCCYAAGG-3 ' ；
[0019] 上游内引物FIP: 5' -GCTACAGGYGCCGCRATAGCGGATCC(XCAGAGGTCAACAATGAGG-3' ；
[0020] 下游内引物BIP: 5 ' -TACAAGCCCCTGGTGGAGA(;TGGATCCCGCGCTCCAYAGTATYTCAC-3，；
[0021] 所述的 R为 A/G，Y为 C/T。
[0022]本发明建立了敏感高、特异高、简便的RT-LAMP检测NV病毒的方法，并且将简并引 物引入其中以增强检测的特异性。该方法只需一台水浴锅在一个小时内即可完成。而且，可 直接用肉眼观察，使之便于在简易实验室用于病原诊断。该方法在野外实验中，也显示出很 高的灵敏性，能够用于临床试验。
[0023] RT-LAMP比RT-PCR快约60min，敏感度高，有两个实验可以证明。一个是梯度稀释 RNA模板来进行扩增；另一个是50个临床样品检测。扩增引物的设计要考虑到RNA病毒基因 组容易变异这一点。本发明设计的简并引物能够特异地扩增NV，并不能扩增其他种病毒的 基因组。
[0024]总之，本发明建立的检测NV的RT-LAMP技术简便、特异、灵敏，适用于野外和简易实 验室检测，提供了新的病毒检测方法。设计了一套RT-LAMP简并引物，建立了检测NV的一步 法RT-LAMP技术，能简便、特异、灵敏检测尿囊液和组织样品中的NV;并优化了反应温度(64 °C )、反应时间（40min)等参数。在样品检测中，RT-LAMP技术的灵敏度达97.7 %，高于RT-PCR 的90.7%，更适用于野外样品和简陋实验室的快捷检测，可广泛应用于医院、食品行业、出 入境检验检疫及质量监督等部门及领域。
【附图说明】：
[0025] 图1是不同反应温度扩增的结果，其中M，DL2000 DNA Marker;65、64、63、62、61、 60、59分别代表65 °C、64°C、63 °C、62 °C、61°C、60 °C、59 °C，N，阴性对照；
[0026] 图2是不同反应时间扩增的结果，其中M，DL2000 DNA Marker;60、50、40、30、20分 别为60min, 50min，40min, 30min，20min;N，阴性对照；
[0027] 图3是不同Mg2+浓度扩增的结果，其中M，DL2000 DNA Marker;泳道1-4的MgS〇4浓度 分别为511^、411^、311^、211^时的1^^扩增结果4为阴性对照