'和 3 '两端的芘分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在 480到500nm之间。
[0017] 以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白浓 度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH4CI、Tris、EDTA-Na 2 的红细胞裂解液为含有卜280 mmol/L NH4CI，1~34 mmol/L Tris，l~2mmol/LEDTA-Na2，pH 7.0~7.2;所述含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCl2;所述荧光检测仪为具 有时间分辨荧光测定的荧光检测仪。
[0018] 以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白浓 度的方法，其特征在于，该检测方法用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的甲胎蛋白浓度。
[0019] 本发明的原理是:在不与甲胎蛋白时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两 端的芘分子单体相互游离，荧光发射波长在370到400nm之间；与甲胎蛋白结合时，甲 胎蛋白诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成 二聚体，芘激发态发射波长二聚体在480到500nm之间。芘激发态二聚体荧光寿命有着长 达100 ns，比生物样品自发荧光寿命(约为5 ns)长，通过检测甲胎蛋白核酸适体探针和样 品混合后的荧光强度和荧光寿命，计算样品中甲胎蛋白的浓度。
[0020] 本发明的实质性特点和显著进步是： (1) 检测操作简单快速，无需复杂样品加工和分离，将核酸适体探针直接加入裂解后的 血样液，用焚光分光光度计短时间内就可以检测480~500nm处的焚光值； (2) 本试剂盒及其检测方法具有灵敏度高，检测结果重复性高，样品检测误差在0.01~ 0.1%之间，特异性强，甲胎蛋白核酸适体荧光探针不与甲胎蛋白结合时，核酸适体处于比较 松散的结构，5'和3'两端的花分子单体相互游离，焚光激发后发射波长在370~400nm之 间；其与甲胎蛋白结合时，甲胎蛋白诱导其发生改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相 互靠近，形成二聚体，荧光激发后二聚体发射波长在480~500nm之间。
[0021] (3)所用的试剂可以使配制好可直接使用的液体试剂或是使用前加水溶解后使用 的干粉状态，检测试剂可以常温贮存，运输方便。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合表1和实施例描述本发明基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白AFP试剂盒 及其检测方法。
[00231 弃1 偷仿||由的试薄丨合试薄丨成分铂成
实施例1 按照表1中实施例1所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试 剂;使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下： (1) 血样裂解:将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置30min，再中速 离心7min，收集上清； (2) 混合卵育：取20μ1步骤1)得到的上清和45ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核 酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5min，得到测试 液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算:使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合 步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
[0024] 样品的3个平行测定误差为0.03 ± 0.01%。
[0025] 实施例2 按照表1中实施例2所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试 剂;使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下： (1)血样裂解:将末梢血、红细胞裂解液按体积比1: 2.5混匀，静置5min，再中速离心 6min，收集上清； (2 )混合卵育:取50μ1步骤1)得到的上清和30ul的 用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探 针试剂混合，室温下卵育6min，得到测试液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算:使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合 步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。样品的3个平行测定误差为0.05 ±0.01%。
[0026] 实施例3 按照表1中实施例3所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试 剂;使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下： (1)血样裂解:将末梢血、红细胞裂解液按体积比1: 3.5混匀，静置lOmin，再中速离心 5min，收集上清； (2 )混合卵育:取75μ1步骤1)得到的上清和45ul的 用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探 针试剂混合，室温下卵育7min，得到测试液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算:使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合 步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
[0027] 样品的3个平行测定误差为0.03 ± 0.01%。
[0028] 实施例4 按照表1中实施例4所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试 剂;使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下： (1) 血样裂解:将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置25min，再中速 离心8min，收集上清； (2) 混合卵育:取100μΙ步骤1)得到的上清和50ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核 酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育8min，得到测试 液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算:使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合 步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
[0029] 样品的3个平行测定误差为0.06 ±0.01%。
[0030] 实施例5 按照表1中实施例5所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试 剂;使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下： (1) 血样裂解:将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:1.0混匀，静置20min，再中速 离心9min，收集上清； (2) 混合卵育：取80μ1步骤1)得到的上清和30ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核 酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育9min，得到测试 液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算:使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合 步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
[0031] 样品的3个平行测定误差为0.06 ± 0.01%。
[0032] 实施例6 按照表1中实施例6所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试 剂;使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下： (1) 血样裂解:将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:4.5混匀，静置15min，再中速 离心1 Omin，收集上清； (2) 混合卵育：取30μ1步骤1)得到的上清和40ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核 酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育lOmin，得到测试 液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算:使用生物医