干血片样品中25羟基维生素d的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及25羟基维生素 D检测的技术领域，特别涉及一种改良的液相色谱串联 质谱法检测25羟基维生素 D。
【背景技术】
[0002] 近十年来，大量研究显示维生素 D在健康和疾病中发挥重要作用（Ho lick MF.Deficiency of sunlight and vitamin D.BMJ 2008；336:1318-9.Holick MF,Chen TC.Vitamin D deficiency:a worldwide problem with health consequences.Am J Clin Nutr 2008;87:10803-63.)。维生素0不仅与佝偻病、骨质疏松等密切相关，与癌症、高 血压、糖尿病、多发性硬化症、抑郁等也存在关系（Holick MF.Vitamin D deficiency.N Engl J Med 2007;357:266-81.)。研究显示幼年时期维生素 D水平与童年晚期或者成年时 期的许多紊乱疾病存在联系（McGrath J.Does'imprinting'with low prenatal vitamin D contribute to the risk of various adult disorders?Med Hypotheses 2001;56: 367-71.)，例如研究显示，胎儿期低维生素 D水平不仅与新生儿股骨长度有关(Morley R， Carlin JB,Pasco JA,ffark JD.Maternal 25-hydroxyvitamin D and parathyroid hormone concentrations and offspring birth size.J Clin Endocrinol Metab 2006； 91:906-12·)，还会在 9 岁时降低骨密度（Javaid MK,Crozier SR, Harvey NC,et al.Maternal vitamin D status during pregnancy and childhood bone mass at age 9years: a longitudinal study .Lancet 2006; 367:36-43 .)。鉴于维生素 D 水平与健康息息 相关，其水平的评估也越来越引起关注。25羟基维生素 D是维生素 D的稳定代谢物，能够准确 评估维生素 D的水平。传统的维生素 D检测方法是一些放射免疫的方法，由于存在蛋白交叉 反应，定量不准确。有文献报道维生素 D2和D3这两种形式的维生素 D在生物活性和生物利用 率上可能具有差异(Armas etc，（ 2004) J · Cl in · Endocrinol · Metab · 89:5387-5391 )，而传统 的免疫方法不能区分维生素 D2和D3。现在越来越多的维生素 D检测采用液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS)的方法，该方法可以同时定量25羟基维生素 D2和25羟基维生素 D3,评估体内维 生素 D2 和 D3 的水平（Asuka Mochizukl，Yoshio Kodera，Tatsuya Saito，et al .Preanalytical evaluation of serum 25-hydroxyvitamin D3and 25-hydroxyvitamin D2measurements using LC-MS/MS. Cl inica Chimica Acta 420(2013) 114-120)，并且方法专属性和灵敏度性高。传统的25羟基维生素 D检测方法有放射免疫法、 竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等，但是主要存在如下问题:第一、由于25羟基维生素 D在 人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存 在严重的基质干扰。而传统的放射免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰;第 二，现有检测技术，前处理复杂、分析时间长，方法特异性差;第三，不能同时准确定量25羟 基维生素 D2和25羟基维生素 D3的含量，无法给出准确的25羟基维生素 D的含量;第四，整个 检测过程时间长、通量低。本发明对25羟基维生素 D检测方法进行改良，前处理更加简单、方 便，仅仅需要一步溶剂处理过程，达到蛋白沉淀和样本萃取双重效果，时间大大缩短。衍生 步骤，显著的提高了样本检测的灵敏度，可以将传统方法几百微升的样本量减少到几微升。
[0003] 本申请检测的样本是干血片样本，可以居家采样，不用专业人员采样，样本量少， 常温保存和运输。不像常规的VD检测，需要到医疗机构，有专业人员采样，而且样本量大，样 本需要专业人员离心处理，并冷冻保存和运输。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是解决现有25羟基维生素 D检测方法技术中存在的部分问题，提供 一种干血片样品中25羟基维生素 D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] -种干血片样品中25羟基维生素 D的液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：
[0007] (1)样本前处理：用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液10μ1的第一离心管 中，加入500μ1丙酮，超声提取30min后，2500rpm涡旋30min;将提取液转移到第二离心管中， 60°C吹干；
[0008] 衍生:将100μΙ衍生剂加入到吹干后的残渣中，室温下反应lh后加入80μ1乙醇，涡 旋 5min，60°C 吹干；
[0009] 复溶：将50μ1 80 %甲醇加入衍生吹干后的残渣中进行复溶，涡旋5min，13000rpm 离心3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析；
[0010] (2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所 述色谱条件如下：
[0011] 流动相C为纯甲醇，流动相D为纯水，柱温30°C，检测时间为5min，进样量为20μ1;
[0012] 采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1;
[0013] 表1为梯度洗脱参数
[0014]
[0015] 25羟基维生素 D3衍生物的保留时间为3.6min;
[0016] 25羟基维生素 D2衍生物的保留时间为3.8min;
[0017] 所述多反应监测MRM质谱参数见表2，
[0018] 表2为质谱参数 [00191
[0020] 优选地，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用APCI离子源，检测离子对m/z分 别是：25-OHD3-PTAD 558 · 4-298 · 2、25-OHD2-PTAD 570 · 4-298 · 2、内标564 · 4-298 · 2，离 子源位置为2.0;气帘气(⑶R)为10,碰撞气(CAD)为6,离子喷雾电流(NC)为4,温度为600 °C， 离子源气流(GS1)为60。
[0021]优选地，所述内标溶液浓度为50ng/ml。
[0022] 优选地，所述衍生剂为4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮，浓度为200μg/ml。
[0023] 优选地，所述涡旋采用涡旋混匀器。
[0024] 优选地，所述涡旋混匀器的转速为2500rpm。
[0025] 优选地，所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本、质控干血斑样本和需要检测的 血斑样本。
[0026] 优选地，所述干血斑标准曲线样本的制备:取2ml处理过的全血，分别与4μ1、10μ1、 20μ1、50μ1、100μΙ、200μ1浓度为lμg/ml的25-OHD混匀，即得2-100ng/ml干血斑标准曲线样 本，分别取75μ1制备好的上述样本滴到903滤纸上晾干即得。
[0027] 优选地，所述质控干血斑样本的制备:取2ml处理过的全血，分别与16μ1、40μ1、80μ 1 浓度为lμg/ml 的25-OHD混勾，即得8ng/ml(Ql)、20ng/ml (Q2)、40ng/ml(Q3)质控干血斑样 本，分别取75μ1制备好的上述样本滴到903滤纸上晾干即得。
[0028] 优选地，所述处理过的全血通过将全血离心，去除上层血浆，将血细胞用0.9%生 理盐水洗涤3次后，与生理盐水1:1混匀即得。
[0029] 本发明的另一方面是通过以下方案实现的：
[0030] 干血片样品中25羟基维生素 D的液相色谱串联质谱检测的试剂盒，所述试剂盒包 含以下溶液：
[0031] (1)洗脱液：
[0032] 洗脱液C:甲醇，纯度为100%;
[0033]洗脱液D:纯水；
[0034] (2)标准曲线干血片样品：含25羟基维生素 D2，25羟基维生素 D3的干血片，浓度为 0-100ng/ml；
[0035] (3)内标溶液:含有d6-25羟基维生素 D3的甲醇溶液；
[0036] (4)萃取剂:丙酮，纯度为100%;
[0037] (5)衍生液：200μg/ml的4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD);
[0038] (6)终止液：乙醇，纯度为100%;
[0039] (7)复溶液:80%的甲醇；
[0040] (8)质控品干血片样品：含有25羟基维生素 D2,25羟基维生素 D3的干血片样品，浓 度分别为QC1: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml。
[0041]本发明的有益效果:通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批 量处理；同时APCI为大气压力化学电离源，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高 压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最后检测，对极性小的样品效果较好，大大 提高了检测信号的灵敏度;方法学考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定 量分析要求;柱温为30°C，接近于常温，有利于被检测化合物的稳定，申请人检测的化合物 已经是经过衍生后的，这个温度能减少降解，提高检测准确度。
【附图说明】
[0042]图1:标准品中25羟基维生素 D3、D2及内标衍生化后总离子流色谱图；
[0043]图2:干血片样品中25羟基维生素 D3、D2及内标衍生化后总离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0044] 为了更好地说明本发明，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述。
[0045] -种干血片样品中25羟基维生素 D的液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：
[0046] (1)样本前处理：用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液10μ1的第一离心管 中，加入500μ1丙酮，超声提取30min后，以转速2500rpm涡旋30min;将提取液转移到第二离 心管中，60 °C吹干；
[0047] 衍生:将100μΙ衍生剂加入到吹干后的残渣中，室温下反应lh后加入80μ1乙醇，涡 旋 5min，60°C 吹干；
[0048] 复溶：将50μ1 80 %甲醇加入衍生吹干后的残渣中进行复溶，涡旋5min，13000rpm 离心3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析；
[0049] (2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，