三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品安全检测免疫分析技术领域，具体而言，涉及一种三唑磷生物条 形码免疫分析测定试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着高毒农药品种将逐步从市场退出，三唑磷已成为替代甲胺磷农药的主要品 种，近年来其使用量迅速增加，广泛用于长江中下游流域水稻二化螟的防治。在三唑磷农药 在我国正进入市场旺季的同时，国外已经开始限制或禁止三唑磷农药的使用与销售。2004 年11月28日，国家质检总局发布紧急预警，称欧盟于12月31日起正式禁止320种农药在欧盟 销售。其中涉及中国正在生产、使用以及出口的农药达60多个品种，其中就包括了三唑磷农 药。其他国家和地区对三唑磷的最大残留限量也提出了越来越严格的标准：日本规定稻米 中三唑磷的最大残留限量(MRL)为不得检出；欧盟除茶叶为0.05mg/kg、棉籽0. lmg/kg外，其 余样品为0.02mg/kg;我国三唑磷的最大残留限量一般都限定为0.05mg/kg。因此，加强三唑 磷检测方法学研究对于保障我国食品安全和农产品贸易具有重要意义。
[0003] 免疫分析方法的作用和地位目前已得到国内外学者的广泛认可，免疫分析方法的 研究也是检测方法研究最热门的领域之一。在免疫分析方法领域中，我国在酶联免疫分析 方法方面开展了较为深入的研究，包括半抗原合成、抗体制备、标记物偶联、反应体系中各 种理化性质对免疫分析方法的影响及半抗原结构与其所制备得到抗体之间的构效关系等 方面。近年来，我国学者在焚光免疫分析、化学发光免疫分析、生物传感器和生物条形码免 疫分析方法方面也开展了较多的研究工作。
[0004] 基于磁性纳米粒子的生物条形码免疫分析方法，利用生物条形码信号放大作用及 磁性纳米粒子的分离富集作用，其最低检出限相对于ELISA方法提高了几个数量级，致使其 从诞生以来，便获得了科学界的高度关注。生物条形码指的是可结合在纳米粒子上的大量 相同序列的DNA片段。该方法最早是用于对前列腺特异性抗原（Prostatespecif ic Antigen，PSA)的检测。该方法主要包括:磁性纳米粒子表面修饰PSA单克隆抗体，胶体金纳 米探针表面修饰起信号放大作用的生物条形码和针对PSA的另一种抗体。在PSA存在时，磁 性纳米粒子、PSA、胶体金纳米探针通过抗原抗体反应形成"三明治"夹心复合结构。形成的 复合物经磁场分离，富集的磁性纳米探针通过高温低盐法变性，释放生物条形码，通过检测 解离下来的生物条形码含量便可以间接得到PSA的含量。
[0005] 生物条形码分析方法近十年来在痕量蛋白质和核酸检测方法得到了快速的发展， 通过与免疫反应相结合建立的生物条形码免疫分析方法，将免疫分析方法的检测限提高到 了一个新的高度。然而该方法建立至今，只能通过构建"三明治"结构模式实现对蛋白质等 大分子物质的检测。由于三唑磷为小分子化合物，通常情况下只有一个抗原结合位点，因此 目前生物条形码免疫分析方法采用的"三明治"结构模式基本不能适用于三唑磷的检测。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒，使用该试剂 盒可以特异地定量检测水中或食品中三唑磷含量。该试剂盒通过竞争反应体系进行检测， 克服了目前生物条形码免疫分析方法采用的"三明治"结构模式基本不能适用于三唑磷的 检测的缺陷。
[0008] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009] -种三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括盒体，所述盒体内 包含有：
[0010] 三唑磷标准品、三唑磷磁性纳米探针、单标胶体金纳米探针、三唑磷双标胶体金纳 米探针、DNA生物芯片、银染试剂。
[0011 ]三挫磷（Tr iazophos)分子式：C12H16N3O3PS; CAS 号：24017-47-8。
[0012] 本发明通过改变生物条形码免疫分析方法的现有反应模式，建立基于小分子竞争 反应模式的生物条形码免疫分析方法。通过将三唑磷与载体蛋白的偶联物包被于磁性纳米 粒子表面制备三唑磷磁性纳米探针，并于胶体金纳米探针表面结合农药抗体和起信号放大 作用的生物条形码用以制备三唑磷双标胶体金纳米探针，利用磁性纳米粒子表面的包被抗 原与农药分子竞争结合胶体金纳米探针表面的抗体建立竞争型免疫化学反应体系。利用磁 分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物，采用热变性技术促使胶体金纳米探针释放生物 条形码，并利用DNA芯片探针和单标胶体金纳米探针杂交结合生物条形码，进而利用金标银 染法测定生物条形码含量，实现对三唑磷农药的定量检测。
[0013] 该试剂盒的使用效果具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。并且，根据本发明 的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推广使用，为食品安全检测 提供一种非常有价值的检测手段。
[0014] 优选的，所述三唑磷磁性纳米探针由磁性纳米粒子和三唑磷完全抗原偶联而成； 所述三唑磷完全抗原由三唑磷和载体蛋白偶联而成。
[0015] 进一步优选的，所述载体蛋白为鸡卵白蛋白；所述磁性纳米粒子的粒径为18~ 22nm〇
[0016] 鸡卵白蛋白（Ovalbumin，OVA)也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，分子量约 43KcL0VA作为惰性蛋白，它能维持胶体金的胶体稳定，起着有分散胶体金颗粒的骨架作用。
[0017] 惰性蛋白也可选用酪蛋白（Casein)或牛血清白蛋白（BSA)等。
[0018] 磁性纳米粒子的粒径对三唑磷完全抗原的偶联数量有着很大的影响，从而影响着 最终反应的灵敏度。
[0019] 优选的，如上所述的试剂盒：
[0020]所述单标胶体金纳米探针由单链DNA1包被胶体金颗粒得到；
[0021]所述三唑磷双标胶体金纳米探针由抗三唑磷抗体和双链DNA包被胶体金颗粒得 到；
[0022] 所述DNA生物芯片由单链DNA2点制得到；
[0023] 所述双链DNA由硫醇修饰的单链DNA和条形码单链DNA互补配对而成；所述单链 DNA1和单链DNA2与所述条形码单链DNA存在互补配对关系，且配对区域不重叠。
[0024] DNA生物芯片上点制的DNA2为捕获DNA，能与条形码DNA互补配对并将其捕获在芯 片上;单标胶体金纳米探针上的DNA1的作用在于进一步放大条形码DNA信号。
[0025] 双标胶体金纳米探针是双链DNA包被胶体金颗粒和抗被检物的抗被检物抗体，双 链DNA中的1条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另1条DNA链是用来指示被检物的条形码 DNA。每一个胶体金颗粒上标记有很多条的条形码DNA，因而起到方法信号的作用，灵敏度较 尚。
[0026] 在实际操作中，条形码DNA的选择为现有技术，只要特异性和灵敏度够好即可。 [0027]优选的，所述胶体金颗粒的粒径为13~15nm。
[0028] 本申请的技术要点是通过形成三唑磷磁性纳米探针-三唑磷双标胶体金纳米探针 的结合，与三唑磷-三唑磷双标胶体金纳米探针的结合进行竞争，并且前者的结合应该可以 均一的分离。灵敏度提高的关键在于被检物的有效回收和作为每个被检物识别结合位点对 应的条形码DNA链的有效释放。条形码DNA的量对应被检物的量(三唑磷磁性纳米探针对被 检三唑磷的竞争性结合的抑制率），因此可以通过定量条形码DNA间接定量痕量的被检物。 三唑磷磁性纳米探针-三唑磷双标胶体金纳米探针的结合实质是磁性纳米探针中的三唑磷 完全抗原与双标胶体金纳米探针中的抗三唑磷抗体的结合，而二者的结合强度与抗体/抗 原的量密切相关，抗体/抗原的量则与胶体金颗粒/磁性纳米粒子的粒径密切相关。
[0029] 优选的，如上所述的试剂盒，所述三唑磷双标胶体金纳米探针具体由以下方法制 备得到：
[0030] 1 )、取胶体金溶液调pH至8.8~9.2后向其中加入抗三唑磷抗体，搅拌混合，静置25 ~35min;然后加入硫醇修饰的单链DNA链，8~12°C静置36~44h;再调整pH至7.3~7.5，加 入似01至浓度0.08~0.12111〇1八，8000~110001'/111；[11离心8~12111；[11，弃上清，得到含寡核苷 酸的胶体金；
[0031 ] 2 )、用牛血清白蛋白浓度为0.8~1.2 %的磷酸盐缓冲液重悬所述含寡核苷酸的胶 体金，孵育1~3h;再加入与所述硫醇修饰的单链DNA链互补的生物条形码DNA链，室温杂交3 ~5h，8000~11000r/min离心，弃上清，得到所述三唑磷双标胶体金纳米探针。
[0032] 进一步优选的，在加入NaCl至既定浓度时，在120~180min内分2~4次等量加入， 每次间隔40~60min。
[0033]加入NaCl的过程即DNA的老化过程。纳米金和DNA都带负电，所以会相互排斥，加入 NaCl可以屏蔽掉纳米金表面的一些电荷，减少纳米粒子间的排斥。但过高浓度的NaCl会导 致盐离子强度过大，易引起D