一种孤独症血清多肽标志物apoc1-a及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于孤独症检测技术领域，涉及一种新的孤独症血清多肽标志物AP0C1-A 及其应用。
【背景技术】
[0002] 孤独症，也称为孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorders，ASD)，是一种以社 会功能缺失、言语和非言语沟通异常，以及行为和兴趣刻板局限为主要特征的广泛神经发 育障碍，患病率约1 %。一般发病于3岁前的幼儿期，并持续终生，男孩发病率是女孩的4~6 倍。研究表明，ASD的早期诊断和筛查有助于增加孤独症儿童从早期干预中获益的机会。然 而由于缺乏生物标志物，目前对ASD的筛查诊断主要以儿童的行为特征及发育史为基础，因 此存在争议，亟需筛选可量化生物学诊断指标。ASD发病率逐年增加，已经引起了学术界的 广泛关注。该病的诊断最初起源于对一组病人临床症状的观察，从有孤独症诊断至今，由于 缺乏可量化的指标，诊断标准修改过多次。孤独症诊断标准的主要内容均为症状描述，并且 其症状存在多样性，学界对其以症状表述为主的诊断标准存在争议。因此，筛查ASD可量化 的生物学指标、生物标志物的鉴定、不仅有利于其早期筛查及诊断，对该病发病机制的探 讨、诊断标准的制定及治疗药物的研制亦具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种孤独症血清多肽标志物AP0C1-A及其应用，该分子多 肽为载脂蛋白Cl (AP0C1)的一个片段，是孤独症血清多肽标志物。
[0004] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0005] -种孤独症血清多肽标志物AP0C1-A，其氨基酸序列如SEQ. ID.N0.1所示。
[0006] 该多肽标志物AP0C1-A为载脂蛋白AP0C1的一个片段，分子量为6638道尔顿。
[0007] 所述的孤独症血清多肽标志物AP0C1-A，其血清中的检测参数为107.24~ 270.03mg/L〇
[0008] 本发明还公开了所述的孤独症血清多肽标志物AP0C1-A作为孤独症血清诊断药物 的靶点的应用。
[0009] 本发明还公开了所述的孤独症血清多肽标志物AP0C1-A在制备孤独症血清诊断药 物中的应用。
[0010]所述孤独症血清诊断药物为ELISA检测孤独症血清多肽分子的药物。
[0011]本发明公开了与所述的孤独症血清多肽标志物AP0C1-A相结合的分子在制备孤独 症血清诊断药物中的应用。
[0012] AP0C1蛋白作为孤独症血清诊断药物的靶点的应用。
[0013]与AP0C1蛋白相结合的分子在制备孤独症血清诊断药物中的应用。
[0014]所述孤独症血清诊断药物为ELISA检测孤独症血清多肽标志物的药物。
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0016] 本发明公开了 一种孤独症血清多肽标志物AP0C1-A及其应用，其氨基酸序列如 SEQ. ID. NO. 1所示。该分子称为AP0C1-A，为载脂蛋白Cl (AP0C1)的一个片段。其精确分子量 为6638道尔顿，在孤独症患儿血清中呈现显著高表达:而在正常对照人群血清中表达范围 为:66.14~126.97mg/L;在孤独症患儿血清中表达范围为：107.24~270.03mg/L，且组间具 有极显著差异(P〈〇.001)。
[0017] 鉴于AP0C1-A在孤独症血清中显著高表达，那么AP0C1-A就可以作为孤独症血清诊 断标志物;且其母本蛋白AP0C1在孤独症患儿血清中呈现特异性的高表达，因此，AP0C1可应 用于孤独症患儿血清诊断：用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-T0F-MS)检 测AP0C1-A或ELI SA方法测检测AP0C1的表达水平，可作为孤独症患儿检测的方法。而针对 ELISA检测孤独症血清诊断，AP0C1就可以作为ELISA检测药物的新的靶点。
【附图说明】
[0018] 图1为同一孤独症患儿血清样本的三次重复的蛋白多肽图谱（lKDa~lOKDa);
[0019] 图2为蛋白多肽峰m/z:6638在孤独症患儿和正常对照组中的蛋白多肽表达差异； [0020] 图3为AP0C1-A的MS/MS质谱鉴定图谱；
[0021]图4为孤独症儿童及正常对照儿童血清中AP0C1蛋白的表达水平。
【具体实施方式】
[0022] 本发明提供的孤独症血清多肽分子，是一种新筛选的孤独症血清诊断标志物，其 表达具有特异性，可应用于孤独症诊断。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细 说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0023] 具体的该孤独症血清诊断标志物的筛选为：
[0024] 首先应用液体蛋白芯片技术分离提取孤独症患儿和正常对照儿童血清蛋白多肽， 应用MALDI-T0F-MS捕获孤独症患儿和正常对照人群蛋白多肽图谱，并且采用ClinProTools 2.1软件对比分析孤独症患儿和正常人群血清蛋白多肽谱图差异，找出组间显著差异表达 的蛋白多肽分值，在孤独症患儿血清中显著高表达的蛋白多肽峰值中筛出孤独症血清肿瘤 标志物。
[0025]对于所筛选的孤独症血清诊断标志物的验证为：
[0026]应用HPLC将孤独症患儿血清分离的蛋白多肽混合物分为20~30个组分，在对其进 行二级质谱的鉴定，并且对鉴定出的蛋白多肽采用酶联免疫法进行血清回归分析，结果血 清回归验证证明其在孤独症患儿血清中显著高表达，具有特异性，可以作为孤独症患儿血 清筛查的生物标志物。
[0027] 1、样本的采集与处理：
[0028] 采集自西安交通大学附属儿童医院（2013年1月至2015年12月）的150例（男性130 例;女性20例;平均年龄3.5岁）临床确诊的孤独症患儿和150例正常健康对照儿童(男性130 例;女性20例;平均年龄3.5岁）。样本考虑年龄、性别、采集时间、储存条件是否一致、有无基 础疾病等因素。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黄帽、有隔离胶)采集全血5mL，室温 静置30min;室温离心5min(3000g)，将上层血清分装成100μL7管，立即保存于-80°C，避免反 复冻融。
[0029] 1.2试剂与仪器
[0030] 血清蛋白的提取采用德国布鲁克公司的磁珠试剂盒"弱阳离子型"（MB-WCX)，以及 光谱纯（HPLC级）乙腈、三氟乙酸（德国Merck公司）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA)(美国 Sigma公司）。
[0031 ] 磁珠分离器、600/384AnchorChip革E1板和AutoFlex III基质辅助激光解析电离飞 行时间质谱MALDI-T0F-MS(德国Bruker Daltonics公司）。
[0032] 2、血清蛋白样本的制备
[0033]运用弱阳离子(MB-WCX)磁珠捕获血清蛋白多肽，具体操作步骤如下：
[0034 ] ①用混勾器完全混勾磁珠悬浮液lm i η;
[0035] ②加10yL MB-WCX结合液以及10yL MB-WCX磁珠至PCR管，混匀后加5yL血清，混匀 至少5次，静置5min;
[0036] ③将PCR管放入磁柱分离器，使磁珠贴壁lmin，液体清澈后弃上清液；
[0037]④加100yL MB-WCX冲洗液，在磁柱分离器上前后移动10次PCR管，磁珠贴壁后弃上 清液，重复步骤③、④两次；
[0038]⑤加5yL MB-WCX洗脱液洗涤贴壁的磁珠，并反复吹打10次，磁珠贴壁2min，将上清 液移入干净的离心管；
[0039]⑥加5yL MB-WCX稳定液至离心管并混匀，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-T0F-MS检测或者冻存于-20 °C冰箱24h之内质谱分析。
[0040] 2.2质谱分析
[0041] 将分离收集得到的蛋白样本lyL与10yL的基质α-氰基-4-羟基肉桂酸混匀，取lyL 点在Anchorchip革El板上(德国Bruker公司），每个样本分别点三个祀点以作三次重复。待室 温干燥后将靶板放入质谱仪进行分析，采用FlexControl 2.0软件进行标准品校正后开始 样本检测，每个样本要经过总共300次激光打靶(5次点靶，每次打靶2 X 30次)之后生成质谱 图，获得由不同质核比(m/z)组成的蛋白多肽谱图。采用ClinPr〇T〇〇ls2.1软件结合遗传算 法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处 理总离子流图，消除化学及电物理噪声;分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由 大到小排列，找出组间表达具有显著差异的蛋白多肽峰值(P〈〇.001)。
[0042] 将孤独症患儿组和正常对照组血清样本采用磁珠分离系统处理后，经过MALDI-T0F-MS分析后，对孤独症患儿组和正常对照组的每个样本进行蛋白多肽图谱绘制，在分子 量范围1000Da~10000Da共检测到81个蛋白多肽峰图，且每个样本的三次重复稳定性较高， 如图1所示。
[0043] 采用ClinProTools 2.1软件对质谱捕获的孤独症患儿和正常对照组的血清蛋白 多肽图谱进行分析，将孤独症患儿血清多肽谱图与正常人群进行比较分析，检测到分子量 为6638道尔顿的蛋白多肽峰在孤独症患儿血清中显著高表达(孤独症儿童vs健康对照儿 童：146.19 ± 29.16vs 90.69 ± 15.59，p〈0.001)。结果如图2所示，对M/Z: 6638在孤独症患儿 (红色，峰值在上的曲线)和正常对照(绿色，峰值在下的曲线）中的表达进行比较，发现M/Z: 6638的蛋白多肽峰图在孤独症患儿血清中均显著高表达，因此对其进行序列鉴定并作为标 志物的首选进一步鉴定。
[0044] 3、孤独症血清潜在标志物