用于预防或治疗急性肾损伤的4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d]嘧啶-2-基]-2,6-二 ...的制作方法
【专利说明】用于预防或治疗急性肾损伤的4-[5-(3-氯-苯氧基)-噁唑并 [5,4-D]嘧陡-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸
[0001]本发明涉及用于预防或治疗急性肾损伤(AKI)的{4-[5-(3_氯-苯氧基）-噁唑并 [5，4-d]嘧啶-2-基]-2，6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐，以及其药物组合物。
[0002] 专利申请W02011/086079描述了化合物4-[ 5-( 3-氯-苯氧基）-噁唑并[5，4-d ]嘧 啶_2_基]-2，6-二甲基-苯氧基}-乙酸或其可药用盐以及其制备方法。这种化合物对于 SlPi/EDGl受体具有亲合性。
[0003] 急性肾损伤(AKI)，以前称为"急性肾衰竭"，是出现在各种环境下的常见的和可能 很严重的病症，临床表现为:血清肌酸酐(SCr)短暂升高至无尿性肾衰竭。传统上，通过血清 肌酸酐的升高来测定，AKI被描述为肾功能突然降低(在48小时之内）。最近的KDIG0(改善全 球肾脏疾病预后组织）指南建立了关于诊断标准的共识，这种诊断标准基于下列实验室和 临床数值（Working group of ERBP(European Renal Best Practice)，2〇12 ,NDT 27 : 4263-4272) ^KI被定义和分为下列阶段之一：
[0004] ?在48小时之内，SCr升高2 0 · 3mg/dL;或
[0005] · SCr升高至2 1.5倍基线，在前7天内就已知或推测出现这种状况;或
[0006] ?尿量<0.5mL/kg/小时，持续6小时。
[0007] 在所有就医的患者当中，AKI出现大约7%(Nash等人，2002，Am J Kidney Dis 39: 930-936)，并且根据所使用的定义，垂危患者高达36-67%。在所有重病监护室（I⑶）当中， 严重的AKI出现4-25%，I⑶中大约5%的AKI患者需要肾脏替代治疗(Hoste等人2006 ,Crit Care 逆：R73,Mehta等人2004，Kidney Int 逆：1613-1621 ;Uchino等人2005，Jama 294: 813-818;Uchino等人2006,Crit Care Med 34:1913-1917;0stermann等人2007,Crit Care Med逆:1837-1843) ^KI的最常见的病因是败血症、大外科、血容量过低和药物。形成AKI的 危险因素包括：老年（>75岁）、慢性肾病（CKD，eGFR(估计的肾小球过滤率）<60mL/min/ 1.73m 2)、动脉粥样硬化周围血管疾病、心力衰竭、肝脏疾病、糖尿病和肾中毒的药物。
[0008] 尽管预防策略和支援措施得到发展，但AKI仍然保持高发病率和死亡率，尤其是进 入ICU的那些患者，住院死亡率超过50%。除了死亡率之外，还存在慢性后遗症，包括：出现 慢性肾病（CKD)的高风险和促进形成晚期肾病（ESRD)(Hsu等人2009，Clin J Am Soc Nephrol |:891-898;Ishani等人2009，JASN逆：223-228;Coca等人2009，Am J Kidney Dis 逆:961-973)。发病还伴随着费用升高和长时间住院。
[0009] 无论病原如何，由于没有得到认可的预防或治疗AKI的方法，所以，还存在明显未 得到满足的医学需要。病症的处理基本上是支持性的，对于严重的AKI患者来说，肾脏替代 治疗(RRT)作为护理的中心部分。水化仍然是对比剂肾病(CIN)的最合适的预防法。
[0010] 鞘氨醇-1磷酸盐（SlP)是与五个GPCR(G蛋白偶合受体）结合的脂质介质，称为 SlPi-5(Brinkman等人2007 ,Pharmacol Ther 115:84-105)。循环SiP主要由内皮细胞、血小 板和红细胞产生，并且发现其与血浆蛋白高度结合，包括HDL(高密度脂蛋白）中的ApoM(脱 脂载脂蛋白M) (Hammad等人2012，J Lipids;Karuna等人，2011 ,Atherosclerosis 219:855-863)和白蛋白。SlP1被普遍表达，包括在内皮、免疫和肾脏上皮细胞中表达。SlP1调节许多生 理功能，包括:保持内皮屏障的完整性(细胞骨架重排）、细胞生长、存活、分化、血管生成和 免疫细胞输送。SlP1 在肾脏髓质（Zhu等人2011 ,Am J Physiol Renal Physiol 301 :F35-F41)中高度表达，其是血流和供氧受到特别为尿浓度而设计的血管解剖学限制的肾脏区 域。由于该区域中的细胞具有高耗氧性，所以，髓质尤其易受缺氧伤害的影响。肾皮质管损 伤是髓质损伤和近端管状细胞的直接损伤的结果。肾脏缺血再灌注损伤之后，SlP 1上调 (Awad等人2006，Am J Physiol Renal Physiol 290:F1516_F1524)，并且预计它的活化能 够保持肾脏功能，这是由于三个主要机理：
[0011] ?保持内皮屏障功能。在AKI中，这种屏障受到损伤，导致血管通透性和粘附性能 削弱，
[0012] ?限制近端管状上皮细胞的细胞程序死亡，
[0013] ?降低炎性细胞浸润。在AKI中，炎症经常是对管状上皮细胞和内皮屏障的复合伤 害的结果。
[0014] 文献已经广泛地记录了SlP-SlPi途径在调节内皮屏障完整性中的作用(Wang and Dudek,2009,Microvasc Res 77:39-45；Mc Verry and Garcia,2005,CelI signalling 17:131-139 ； Lucke and Levkau ,2010 ,Cel I Phys Biochem 26:87-96)。SlPi的活化，通过 PLC/Ca2 + /FAK/pRac途径活化来提高内皮的屏障功能（Belvitch and Dudek，2012, Microvasc Res83 : 22-30) aHDL-ApoM结合的SlP通过eNOS活化来延长内皮的屏障功能 (Wilkerson等人2012 JBC 287:44645-44653;Christoffersen等人2011 ,PNAS 108:9613-9618; Argraves等人2008 JBC 283:25074-25081)。关于这一点，在进行血管手术的患者中， 低血浆HDL水平与出现AKI的危险有关(]\^11616了311(1]\^1161陬.，1975，1^1^6七1:16-19;Castelli WP，Garrison RJ，Wilson PW等人 1986，JAMA;256:2835-2838)〇
[0015] SlP1的完全或内皮特异性缺失，由于影响多个器官的大出血而引起胚胎死亡 (Kono等人2004 JBC 279:29367-29373)。在负责SlP生物合成(鞘氨醇激酶1和2)的酶缺失 的剔除小鼠中，可以发现相同的缺陷（Mizugishi等人2005，M〇1 Cell Biol亞：11113-11121)。类似地，SlP1拮抗剂还增加血管通透性。尽管SlPdA能性拮抗剂在AKI模型中具有急 性保护作用（Bajwa等人，2010,JASN 21:955-965;Awad等人2006，Am J Physiol Renal Physi〇1290:F1516-F1524)，但在肺损伤模型中，用这些SlPdj]能性拮抗剂进行长期治疗， 显著地恶化血管渗漏，并且体外破坏（Shea等人2010 ,Am J Respir Cell Mol Biol 43: 662-673)内皮屏障的完整性。在SIP不足的小鼠中，也模拟了类似的内皮缺陷（Camerer等 人，2009JCI 119:1871-1879)。
[0016] 在患者和AKI模型中，从内皮细胞中释放细胞素（例如，TNF-α )，并且上调粘附分 子，例如ICAM-I、VCAM-1和Ρ/Ε-选择蛋白，这有助于炎性细胞渗透到管状间质软组织中 (Bonventre等人2003 JASN 2199-2210;Singbartl等人2000,Crit Care Med 翌：2507- 2514;Sadik等人2012，M〇1 Cell Biochem 359:73-81)。此外，在培养的人类内皮细胞中，在 低氧/再氧化之后，这些内皮粘附分子中的一些粘附分子被上调(Lutz等人2008 J Mol Med 逆：1329-1339) AlP1活化向下调节这些粘附分子，并因此降低炎性细胞浸润（Lien等人 2006 ,Kidney Int逆:1601-1608)。使用内皮31?!受体条件性缺失的小鼠，证明了SlP在急 性肾损伤中保持内皮功能方面的主要作用(Ham A.，2013，Kidney Int,Sept)。
[0017] 刺激SlP1，通过Akt磷酸化，能够激活内皮氧化氮合酶(eNOS)，其是通过产生NO来 调节局部血管舒张的关键酶(]?〇抑168-1?1^2等人2001，贝0 276:19672-19677; Igarashi等 人2000，JBC ^:32363-32370; Igarashi等人2008 ,BBA 1781:489-495)。因此，SlP在内皮 中以NO依赖性方式引起血管舒张(Roviezzo等人2006，FASEB J逆:340)。在I/R引起的AKI 的动物模型中，NO对肾脏功能具有保护作用(Garcia-Cr iado等人1998 ,Transplantation 迚:982-990)。在大鼠中，抑制eNOS能够使肾血流量降低35%，同时降低GFR，并且增加肾血 管阻力（Cao等人 2〇10 ,Am J Physiol Renal Physiol 299 :F1056_F1064) AlP被认为是内 皮一氧化氮的最有效活化剂之一，已经知道的是，它可以使局部血流增加，而且限制血小板 活化和血管充血，尤其在易受损的皮质延髓区域。在AKI期间，这种机理可能对保持肾脏功 能很重要。重要的是，在心肺旁路(CPB)和败血症患者中，一氧化氮生物利用率降低与AKI有 关（Lema等人2009，J Cardio Thorac Vase Anesth 翌：188-194;Sadik等人2012，Mol Cell Biochem 359:73-81)。有趣的是，人类eNOS中的786C多态性降低转录活性，并且与心肺旁路 的心脏手术患者的肾功能障碍有关(Popov等人2009，Eur J Cardio-Thorac Surgery 36: 651-656;Nakayama等人 1999,Circulation 逆:2864-2870)。多态性频率大约为50%，并且 可以代表重要的子群，这种子群不但更加处于出现AKI的危险之中，而且对修复局部NO水平 的治疗产生更大反应，例如，通过SlPj^活化。
[0018] 此外，SlP1的活化，通过激活PERK和PAkt存活途径，直接限制近端管状上皮细胞的 细胞程序死亡。在缺血再灌注损伤之后，近端管状上皮细胞中SlP 1的特异性缺失，恶化肾脏 功能障碍(Bajwa等人2010 JASN 21:955-965)，以及使肾小管坏死，这说明，内原性的SlP增 强（tone)可减缓再灌注损伤的严重程度。这些数据着重说明了 SlP-SlP1系统在AKI中对内 皮和上皮轴的保护作用的重要性。
[0019] 通过SlP1活化SlP决定着淋巴细胞从淋巴结流出到血液中。这种SlP 1活化引起受体 内化作用，而后受体再循环回到细胞表面，进行重新活化。然而，人们认为，SlP1功能性拮抗 剂或诘抗剂通过抑制内化的SlPi受体回到细胞表面或抑制SlPi活化而导致淋巴细胞减少， 由此导致细胞表面SlP 1的显著和持续减少。因此，最近的药剂显示出在临床前和临床上观 察到血液淋巴细胞的大量和持续减少。
[0020] 一些报道表明，T淋巴细胞促进急性肾损伤。通过消耗T细胞并且与⑶4+T细胞的继 承转移进行重组而使损伤得到改善，这种观察结果证明它依赖于⑶4+T细胞（Burne等人 2001 ,J.Clin Invest 翌：1283_1290;Ysebaert等人2004，Kidney Int 逆：491_496)。因 此，毫不奇怪的是，SlPJj]能性拮抗剂，包括芬戈莫德(fingolimod)和SEW2871，在急性肾损 伤模型中，在淋巴细胞减少性剂量下，能够起到保护作用(Lien等人2006,Kidney Int逆： 1601-1608)。
[0021] 然而，淋巴细胞减少是机会感染的诱因，尤其对于很敏感、虚弱的患者，例如，处于 AKI的高风险的患者(老年、心脏疾病、糖尿病和慢性肾病）。因此，还需要选择性的SlP 1激动 剂，这种激动剂应该能够引起有限的淋巴细胞减少，或在最佳情况下，淋巴细胞不减少，并 且在治疗AKI方面具有治疗应用性。意外的是，化合物4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并[5,4-d] 嘧啶-2-基]-2,6-二甲基-苯氧基}-乙酸不同于其它SlP 1调节剂，这是由于它在非淋巴细胞 减少性剂量下，在哺乳动物中引起AKI保护作用。人们相信，4-[5-(3_氯-苯氧基)-噁唑并 [5，4-d]嘧啶-2-基]-2，6_二甲基-苯氧基}-乙酸的这种性能可能与它