作为免疫调节剂的基于球形核酸的构建体的制作方法
【专利说明】作为免疫调节剂的基于球形核酸的构建体
[0001 ] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年7月25日提交的题为"作为用于预防和治 疗用途的免疫刺激剂的基于球形核酸的构建体"的美国临时申请号61/858,584的优先权， 通过引用将其全文并入本文中。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于递送核酸相互作用复合物的拮抗剂的纳米级构建体及其方法和 组合物。
[0004] 发明背景
[0005] 免疫细胞(特别是巨噬细胞、树突状细胞和B细胞)使用Toll样受体(TLR)来了解环 境中的外源材料(诸如细菌成分和外源DNA或RNA 4^3)。这些受体一旦活化之后，通过特定细 胞信号传导途径(主要通过转录因子NFkB 11)产生大的免疫应答。然后，NFkB的活化导致产生 几种分泌的信号传导分子(诸如TNFa)，其促进免疫应答至相邻的免疫细胞 n。这种免疫感觉 系统(sensory system)被称为固有免疫应答。在几种自身免疫性疾病中，身体将自身成分 (诸如DNA或RNA)不正确地识别为外源成分，并会启动(mount)大规模的炎性应答，如果不受 控制的话，其可以是破坏性的、痛苦的和威胁生命的。这种情况的最流行的实例包括如果没 有进行仔细调控则主要侵袭关节并且会破坏软骨和骨的类风湿性关节炎以及如果不受控 制则也会侵袭内部器官(诸如心、肾和肺)并可能致命的狼疮。目前的治疗主要依赖于通过 TNFa结合抗体(依那西普等)来隔绝（sequestering)免疫细胞所得到的细胞因子的产生以 及用化学治疗剂（诸如氨甲蝶呤）进行全身（general)免疫抑制和消除B细胞群体以延缓 (stave off)适应性免疫应答。但是，这些治疗常常很难容忍和/或随时间推移变得易于获 得耐药性。因此，针对该信号传导级联的开始时TLR活化的拮抗剂的开发应当是阻断患有自 身免疫性紊乱的患者中自身DNA和RNA的不适当识别的强效疗法。
[0006] TLR 7、8和9均驻留于免疫细胞的内体。TLR 9识别未甲基化的CpG基序，其在细菌 DNA中常见但在人DNA中不常见5'1(3。11^7和8二者均识别在病毒感染中常见的短单链RNA的 特异性序列& 8。重要的是，这些能够拮抗它们各自TLR并阻断下游信号传导的常见识别基序 的模拟物是已知的12~。但是，它们在治疗中的用途被它们能够被递送至病理部位而不被体 内降解的能力所限制。
[0007] 发明概述
[0008] 本文中所述的是使用纳米级构建体通过调节受体相互作用(诸如TLR)用于调控免 疫应答的新方法和组合物。本发明的方面涉及纳米级构建体，其具有核酸相互作用复合物 的拮抗剂的冠部，其中核酸相互作用复合物的拮抗剂的表面密度为至少〇.3pmol/cm 2。
[0009] 在其他方面，本发明是构建体，其具有核酸相互作用复合物的拮抗剂的冠部，以及 被并入冠部的抗原。在一些实施方案中，抗原的表面密度为至少〇.3pmoΙ/cm 2。在其他实施 方案中，抗原包括至少两种不同类型的抗原。
[0010] 在又一些其他方面，本发明是构建体，其具有并入了核酸相互作用复合物的至少 两种拮抗剂的冠部，其中拮抗剂选自由TLR 3、7/8和/或9的拮抗剂组成的组。
[0011] 在一些实施方案中，核酸相互作用复合物的拮抗剂含有间隔子。
[0012] 在其他实施方案中，核酸相互作用复合物的拮抗剂是RNA或DNA。核酸相互作用复 合物的拮抗剂可以是例如双链RNA或双链DNA。备选地，核酸相互作用复合物的拮抗剂可以 是单链RNA。在一些实施方案中，核酸相互作用复合物的拮抗剂为未甲基化的脱氧核糖核 酸，诸如优化的免疫调节序列。
[0013] 在某些实施方案中，纳米级构建体包括纳米颗粒核心并且任选地纳米颗粒核心是 金属的。在某些实施方案中，金属选自由金、银、铂、铝、钯、铜、钴、铟、镍及其混合物组成的 组。在某些实施方案中，纳米颗粒核心包含金。在某些实施方案中，纳米颗粒核心是包括可 降解金的晶格结构（lattice structure)。在一些实施方案中，纳米级构建体是可降解的。
[0014] 在某些实施方案中，纳米级构建体的直径是平均直径Inm至大约250nm、平均直径 大约Inm至大约240nm、平均直径大约Inm至大约230nm、平均直径大约Inm至大约220nm、平均 直径大约Inm至大约21〇11111、平均直径大约1111]1至大约20〇11111、平均直径大约1111]1至大约19〇11111、 平均直径大约Inm至大约180nm、平均直径大约Inm至大约170nm、平均直径大约Inm至大约 160nm、平均直径大约Inm至大约150nm、平均直径大约Inm至大约140nm、平均直径大约Inm至 大约130nm、平均直径大约Inm至大约120nm、平均直径大约Inm至大约llOnm、平均直径大约 Inm至大约lOOnm、平均直径大约Inm至大约90nm、平均直径大约Inm至大约80nm、平均直径大 约Inm至大约70nm、平均直径大约Inm至大约60nm、平均直径大约Inm至大约50nm、平均直径 大约Inm至大约40nm、平均直径大约Inm至大约30nm或者平均直径大约Inm至大约20nm或者 平均直径大约Inm至大约10nm。
[0015] 在其他方面，本发明是纳米级构建体，其具有核酸相互作用复合物的拮抗剂的球 形冠部，其中拮抗剂是具有至少一个核苷酸间磷酸二酯键的核酸。在一些实施方案中，核酸 的每个核苷酸间键是磷酸二酯键。
[0016] 在本发明的一些实施方案中，冠部是球形冠部。
[0017] 在本发明的其他方面中提供了由如本文中所述的纳米级构建体和载体组成的疫 苗。
[0018] 在其他方面中提供了用于向细胞递送治疗剂的方法，其包括向细胞递送本发明的 纳米级构建体。
[0019] 在本发明的其他方面中提供了用于调控靶分子的表达的方法。该方法涉及向细胞 递送本发明的纳米级构建体。在一些实施方案中，靶分子是选自由TLR3、7、8和9组成的组的 TLR 0
[0020] 在本发明的其他方面中提供了用于拮抗TLR的方法，其通过向细胞递送如本文中 所述的纳米级构建体。
[0021] 根据其他方面，本发明是治疗受试者的方法，其涉及向受试者施用有效量的如本 文中所述的纳米级构建体以降低免疫应答。在一些实施方案中，受试者患有感染性疾病、癌 症、自身免疫性疾病、哮喘或变应性疾病、炎性疾病、代谢性疾病、心血管疾病，或者受试者 是组织或器官移植的候选者或者接受者。
[0022] 在其他方面，本发明是调节受试者中免疫应答的方法，其通过向受试者施用有效 量的核酸相互作用复合物的拮抗剂的冠部的纳米级构建体以调节免疫应答，其中所述拮抗 剂是具有至少一个核苷酸间磷酸二酯键的核酸。
[0023] 在某些实施方案中，该方法涉及向细胞递送治疗或检测方式(modality)。
[0024] 本发明进一步的方面涉及试剂盒，其包含:纳米颗粒核心;拮抗剂和用于组装拮抗 剂-纳米颗粒的说明。在某些实施方案中，该试剂盒进一步包含使用说明。
[0025] 本发明的每个限制可以涵盖本发明的各种实施方案。因此，预计涉及任一种元素 或元素的组合的本发明的每个限制可以被包括于本发明的每个方面。本发明不限于所应用 的以下说明中所列出的或附图中所示的成分的构建和排列的细节。本发明能够具有其他实 施方案并以各种方式进行实践或执行。
【附图说明】
[0026] 附图并不旨在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的 成分由相同的标号表示。为了清晰起见，在每幅图中并非每个成分均可被标记。在附图中： [0027] 图1A-1D是证实本发明的构建体(AST-015)能够抑制巨噬细胞样RAW Blue细胞中 CpG诱导的TLR9活化的一组图。图IA显示的是AST-012，图IB显示的是AST-013，图IC显示的 是AST-014，图ID显示的是AST-015。
[0028]图2A-2D是证实用本发明的构建体(AST-015)预处理能够抑制巨噬细胞样RAW-Blue细胞中CpG诱导的TLR9活化的一组图。在用TLR9的激动剂刺激之前用免疫调节构建体 孵育细胞。IC50值以纳摩尔(nM)表示。"未处理"线是指从未经过任何刺激剂(stimulant)的 细胞TLR活化水平。
[0029] 图3A-3D是证实用本发明的构建体(AST-015)和CpG DNA同时处理能够抑制巨噬细 胞样RAW-Blue细胞中CpG诱导的TLR9活化的一组图。在RAW-Blue报告细胞系中针对TLR活化 比较了游离免疫调节DNA(图3A和3B)和免疫调节SNA(图3C和3D)的效力。在这些条件下，在 用TLR9的激动剂刺激的同时用免疫调节构建体孵育细胞。IC50值以纳摩尔(nM)表示。"未处 理"线是指从未经过任何刺激剂的细胞TLR活化水平。
[0030] 图4是证实本发明的构建体(AST-015)能够抑制慢性刺激的巨噬细胞样RAW-Blue 细胞中CpG诱导的TLR9活性的图。在RAW-Blue报告细胞系中针对TLR活化确定游离免疫调节 DNA的效力。在这些条件下，先用TLR9的激动剂构建体预刺激细胞至慢性水平，然后在用 TLR9激动剂再刺激的同时用免疫调节构建体孵育细胞。IC50值以纳摩尔(nM)表示。"未处 理"线是指从未经过任何刺激剂的细胞TLR活化水平。"o/n未处理"线是指经过刺激剂过夜 但在第二天没有接受第二剂量的刺激剂的细胞。
[0031] 图5A和5B是证实AST开发的免疫调节序列4084F7/8能够抑制巨噬细胞样RAW-Blue 细胞中CpG诱导的TLR9活性和ssRNA诱导的TLR7/8活性的一组图。将AST-015中所使用的 4084F序列和AST开发的修饰的4084F7/8序列与来自Dynavax的临床样品的IRS869和IRS954 就对抗TLR9(图5A)和TLR7/8(图5B)的效力进行了比较。IC50值以纳摩尔（nM)表示。"未处 理"线是指从未经过任何刺激剂的细胞TLR活化水平。
[0032]图6显示的是表示含有免疫调节DNA(irDNA)的新的构建体的图。图6显示可以使用 直径13nm的金纳米颗粒合成ir SNA，所述金纳米颗粒作为用于添加硫醇化（thio Iated) irDNA和短乙二醇聚合物的模板。
[0033]图7A-7D是描绘本发明的构建体阻断各种激动剂的能力的图。两种所测试的构建 体均能够阻断所测试的所有三种激动剂:咪喹莫特(TLR7，图7B)、CpG 1826(CpG，TLR9，图 7D)、细菌脂多糖（LPS，TLR4，图7C)的刺激或者能够同时阻断所有三种激动剂的刺激（图 7B)。
[0034]
[0035]本发明不限于所应用的以下说明中所列出的或附图中所示的成分的构建和排列 的细节。本发明能够具有其他实施方案并以各种方式进行实践或执行。此外，本文中使用的 措辞和术语是为了说明的目的，而不应被视为限制。本文中使用"包括"、"包含"或"具有"、 "含有"、"涉及"及其变型是指涵盖其后所列出的项目及其等价物以及其他项目。
[0036]在一些方面，本发明涉及新的含有免疫调节DNA(irDNA)的构建体或颗粒。免疫调 节DNA可以是例如拮抗TLR9、TLR7/8和/或TLR7/8/9的DNA寡核苷酸。颗粒具有吸附其的寡核 苷酸结构的密集排列，其在本文中被等价地称为纳米颗粒构建体、纳米级构建体或irSNA。 这些构建体能够拮抗TLR介导的信号传导，所述信号传导响应于几种自身免疫病理学常见 的含有非甲基化CpG单链寡核苷酸和单链RNA的激动剂。在下面的实施例中呈现了一些示例 性数据。在该数据中显示可以使用直径13nm的金纳米颗粒合成irSNA，所述金纳米颗粒作为 用于添加硫醇化(thi 〇lated)irDNA和短乙二醇聚合物的模板(示于方案1中，图6B)。发现对 抗驻留内体的TLR的、含有irDNA的irSNA能够提供强效和新的向免疫细胞递送irDNA以阻断 紊乱(诸如自身免疫性紊乱诸如类风湿性关节炎）中常见的TLR介导的信号传导途径的过度 活化的方法。这些构建体比现有的用于递送用于治疗紊乱的irDNA的方法显著更有效的发 现是相当出乎意料的。尽管申请人不被机制束缚，相信本发明的构建体中呈现的irDNA的密 度大大增强核酸受体调节。
[0037] 实施例中呈现的数据证实，irSNA是鼠巨噬细胞样细胞(RAW)中TLR9和TLR7/8介导 的NFkB和TNFa免疫活化信号传导的强效抑制剂。在一个实施例中，被并入irSNA的低nM剂量 的免疫调节寡核苷酸序列能够阻断活化的TLR9和TLR7/8介导的NFKB/TNFa信号传导。重要 的是，具有天然磷酸二酯主链的DNA在被并入irSNA时是有效的，而在作为溶液中的游离寡 核苷酸被施用时是无效的。并入含有硫代磷酸酯(ps)主链的序列的irSNA能够与游离DNA施 用一样有效调节TLR的活化，但具有更长释放谱的附加优点。目前大多数基于DNA的疗法想 要发挥任何效力需要硫代磷酸酯主链修饰，但由于硫代磷酸酯介导的全身毒性而被限于治 疗窗口。本发明的构建体能够并入天然的和修饰的主链化学物质（chemistries)的事实大 大增强了用于在该平台上开发的疗法的潜在治疗窗口。
[0038] NFkB和TNFa信号传导途径是自身免疫性紊乱(特别是RA)的急性病理学的主要贡 献者18。传统疗法主要依赖于隔绝（sequestration)策略以下调过度活化的免疫系统的作 用，并且本质上是保守的(reactionary^M^irSNA积极主动地通过阻断主要负责导致活化 促炎细胞应答的信号传导级联的受体调控免疫信号传导。采用该作用机制给治疗自身免疫 性患者(包括RA患者)提供显著潜在改善，例如导致增强的效力，降低的耐药性机会和用于 更大的治疗窗口的潜力。与许多广谱治疗不同，由于irSNA仅阻断主要只存在于免疫细胞中 的这些信号传导途径的过度活化，施用irSNA对于正常组织和细胞的副作用可以得到降低 或者甚至被消除。
[0039]本发明的方面涉及纳米级构建体。纳米级构建体是指具有容纳于几何位置中的一 种或多种核酸的纳米大小的构建体。纳米级构建体通常被称为一组核酸的冠部。本文中使 用的冠部是指由核酸分子组成的外壳。冠部可以具有由核酸或其他材料(诸如金属)组成的 纳米颗粒核心。备选地，冠部可以简单地为以具有中空核心的几何形状排列的一组核酸，即 核酸的三维形状的层。通常、但不总是如此，冠部具有球形形状。
[0040] 在该情况下，当冠部包括纳米颗粒核心时，核酸可以被直接连接至该核心。一些或 所有的核酸可以通过共价键或非共价键被直接或间接连接至其他核酸。一种核酸与另一核 酸的键可以是除了该核酸与核心的键之外的键，或者备选地是该核酸与核心的键。核酸的 一种或多种还可以被连接至其他分子(诸如抗原）。
[0041] 当冠部不包括纳米颗粒核心时，核酸可以通过共价键或非共价键被直接或间接互 相连接。在一些实施方案中，可以通过将核酸在晶格或其他可溶解结构上成层（layering) 形成不包括纳米颗粒核心的冠部，然后溶解晶格或其他结构以产生空的中心。
[0042] 本文中使用的纳米级构建体是具有纳米级（即在大约Inm和1微米之间）平均直径 (average diameter)的构建体。例如，在一些情况下，纳米级构建体的直径是平均直径 (mean diameter)大约Inm至大约250nm、平均直径大约Inm至大约240nm、平均直径大约Inm 至大约230nm、平均直径大约Inm至大约220nm、平均直径大约Inm至大约210nm、平均直径大 约Inm至大约200nm、平均直径大约Inm至大约190nm、平均直径大约Inm至大约180nm、平均直 径大约Inm至大约170nm、平均直径大约Inm至大约160nm、平均直径大约Inm至大约150nm、平 均直径大约Inm至大约HOnm、平均直径大约Inm至大约130nm、平均直径大约Inm至大约 120nm、平均直径大约Inm至大约11〇11111、平均直径大约1111]1至大约10〇11111、平均直径大约1111]1至 大约90nm、平均直径大约Inm至大约80nm、平均直径大约Inm至大约70nm、平均直径大约Inm 至大约60nm、平均直径大约Inm至大约50nm、平均直径大约Inm至大约40nm、平均直径大约 Inm至大约30nm、平均直径大约Inm至大约20nm、平均直径大约Inm至大约10nm、平均直径大 约5nm至大约150nm、平均直径大约5至大约50nm、平均直径大约10至大约30nm、平均直径大 约10至150nm、平均直径大约10至大约IOOnm、平均直径大约10至大约50nm、平均直径大约30 至大约IOOnm或者平均直径大约40至大约80nm〇
[0043] 在一些情况下，冠部包括附接至核酸相互作用复合物的一种或多种拮抗剂和/或 抗原的纳米颗粒核心。本文中使用的纳米颗粒核心是指没有任何附接的形式(modality)的 纳米颗粒构建体的纳米颗粒成分。在一些情况下，纳米颗粒核心是金属的。应当理解的是， 纳米颗粒核心、可以包含任何金属。金属的几种非限制性实例包括金、银、铂、错、钯、铜、钴、 铟、镍及其混合物。在一些实施方案中，纳米颗粒核心包含金。例如，纳米颗粒核心可以是包 括可降解金的晶格结构。纳米颗粒还可以包含半导体和磁性材料。
[0044] 与本发明的方面相容的纳米颗粒的非限制性实例被描述于并被通过引用并入自： 美国专利号7,238,472、美国专利公开号2003/0147966、美国专利公开号2008/0306016、美 国专利公开号2009/0209629、美国专利公开号2010/0136682、美国专利公开号2010/ 0184844、美国专利公开号2010/0294952、美国专利公开号2010/0129808、美国专利公开号 2010/0233270、美国专利公开号 2011/0111974、PCT[0045]本文中使用的核酸相互作用复合物是指与