测量干血斑中无细胞病毒颗粒的方法
【专利说明】测量干血斑中无细胞病毒颗粒的方法 发明领域
[0001] 本发明设及测量血液中病毒载量的领域，并且更具体地讲，设及测量干血斑中无 细胞病毒颗粒的方法。
[0002] 发明背景 2013年，世界卫生组织(WHO)修订了现行的HIV治疗和预防准则并强调了 HIV病毒载量 (VL)测试在对HIV阳性患者的管理中的重要性。WK)强烈推荐使用HIV病毒载量测试替代临 床表现和CD4细胞计数W监测HIV抗逆转录病毒疗法(ART),并且将对于治疗效果的HIV血浆 化水平的截断值从5000份拷贝/mL降至1000份拷贝/mL。换句话讲，如果接受ART治疗的HI V 患者血浆中的病毒滴度大于1000份拷贝/mL，则将看作是药物治疗失败。对治疗失败的应对 (如依从性咨询、药物耐药性测试和二线治疗方案)是耗时且昂贵的，而应当仅在有必要时 使用。
[0003] 在感染后，HIV病毒不仅在被感染的细胞内开始自我复制，还将其cDNA整合至宿主 染色体中作为潜伏的HIV前病毒DNA化reene, W.C.与化terlin, B.M., 2002，fading HIV's remarkable voyage through the cell, Nat Med.8(7): 673-80; Blankson, J.N., D. Persaud, R.F.Siliciano, 2002, The Challenge of Viral Reservoirs in HIV-1 Infection, Annu.Rev. Med. 53: 557-593)。通常使用血浆作为标本类型测量HIV病 毒载量。然而，在资源有限的环境中，如非洲，血浆样品可能不易获得、保存、转移和测试(世 界卫生组织2013,关于使用抗逆转录病毒药物治疗和预防HIV感染的综合准则:对公共卫 生措施的建议。世界卫生组织，日内瓦）。已经就干血斑(DBS)作为在资源有限的环境中HIV 病毒载量测试的解决方案进行了评价，但取得了有限的成功（Smit PW等人，2014， Systematic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral lo曰d 曰nd for e曰rly inf曰nt di曰gnosis, PLoS ONE.9(3): e86461; Bert曰gnolio, S., N.T.Parkin, M. Jordan, J. Brooks, J.G.Garcia-Lerma, 2010; Dried blood spots for HIV-1 Drug Resistance and Viral Load Testing: A Review of Current Knowledge and WHO Efforts for Global HIV Drug Resistance Surveillance, AIDS Rev. 12:195-208; Johannessen, A, 2010; Dried blood spots in HIV monitoring: applications in resource-limited settings, Bioanalysis.2(11):1893-1908)cRoche Molecular Diagnostics(RMD)于2009年开发了一款仅研究使用（RUO)的产品，其使用实时 PCR C0BAS? AmpliPr邱/C0BAS? TaqMan? (CAP/CTM) HIV-1 测试 v2.0和干燥液斑法 (DFSP) W测量DBS中的HIV病毒载量。遗憾的是，当测试成对的血浆和DBS样品时，相比血浆 金标准，DFSP测试得到了更高的病毒载量滴度。运一过高估计在具有血浆病毒载量小于5， 000份拷贝/mL的样品中尤为明显，据推测是由于检测到了与细胞结合的HIV DNA和RNA。
[0004] 根据CAP/CTM HIV-1 DFSP方法，首先将HIV DBS与离液剂-样本预提取(S阳X)缓冲 液一起溫育，而将总核酸，包括血液流体中的HIV病毒RNA，加上其它与细胞结合的HIV DNA 和RNA(如HIV前病毒DNA)，从DBS中提取出并洗脱到SPEX缓冲液中。然后，将提取出的缓冲液 置于CAP/CTM仪器上进行核酸纯化，然后是HIV祀标扩增和检测。现行的用于HIV DBS化测 量的核酸提取方法充分裂解所有细胞并使所有蛋白质复合物变性，使得总核酸(包括血液 流体中的无细胞HIV病毒颗粒和与细胞结合的HIV RNA和DNA)从DBS中被完全提取出。
[0005] 对DBS中HIV化的过度量化不只是Roche的DBS测定的问题，在其它市售测定（如 Abbott的HIV DBS测定）中也有观测到。在HIV科学和医学界，已经推测，存在于DBS中被HIV 感染的细胞内的HIV DNA会造成对病毒载量的过度量化，但运一过度量化现象的确切机制 尚不清楚或尚未得到证实(M自decins Sans Rronti紅es Access Campai即，2013)。可W通 过对RNA比对DNA更有特异性的扩增方法(例如，BioMerieux NucliSENS ?所用的NASBA方 法)来改善但非消除DBS中的过高估计。仍然存在对于解决样品中HIV化过度量化挑战的替 代方法的需求。
[0006] 发明概述 一种对于DBS中过高估计的解决方法可W是:类似于血浆样品，从样品中移除与细胞结 合的RNA和DNA，仅留下待检测的无细胞病毒。运可W防止将患者错误归类为治疗失败而造 成的高昂代价。本公开中描述了此类方法及相关益处。
[0007] 在一个实施方案中，提供了测量干血斑中无细胞核酸和/或病毒颗粒的方法。该方 法可包括W下步骤:将干血样再水化，通过向干血样施加缓冲溶液W产生再水化的干血样； 任选地，使用固定剂将存在于再水化的干血样中的细胞固定W将与细胞结合的RNA和/或 DNA包含在细胞内；使用洗脱剂将无细胞核酸和/或病毒颗粒从再水化的干血样中洗脱，所 述洗脱剂优先地洗脱无细胞病毒颗粒而不破坏与细胞结合的RNA和/或DNA;使用过滤器将 无细胞核酸和/或病毒颗粒从可能存在于再水化的干血样中的任何细胞碎片上分离；W及 通过病毒颗粒定量技术测量无细胞核酸和/或病毒颗粒，所述病毒颗粒定量技术选自：序列 特异性核酸定量、酶联免疫吸附测定(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、等溫核酸扩增、核酸 杂交、原位杂交和电子显微镜。
[0008] 在一些实施方案中，DBS中待测量的病毒颗粒可W是人类免疫缺陷病毒(HIV)、人 类嗜T淋己细胞病毒-1或-2(HTLV-1或-2)、丙型肝炎病毒(肥V)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细 胞病毒(CMV)(例如，人类CMV)和化stein-Barr病毒(EBV)中的一种或多种。缓冲溶液的实施 方案可W包括固定剂和洗脱剂。固定剂的一个实施方案可W是甲醇，且洗脱剂的一个实施 方案可W是憐酸盐缓冲盐水或其它合适的缓冲液。在本方法的一些实施方案中，分离步骤 可包括离屯、柱过滤、真空过滤或离屯、。实施方案可包括孔径在约0.1 μL?至约100 μηι范围内 的过滤器，例如，约20 μηι至约80 μηι，例如，约30 μηι至约70 μηι，例如，约40 μηι至约60 μηι。
[0009] 在另一个实施方案中，缓冲溶液包含PBS。在另外的实施方案中，缓冲溶液包含洗 脱溶液。在一个其它的实施方案中，洗脱溶液包含PBS。
[0010] 在W下的附图和说明书中描述了本发明的一个或多个实施方案的详细内容。从附 图和详细描述W及从权利要求书中，本发明的其它特征、目标和优点将会是显而易见的。
[0011] 附图简述 图1示出了HIV病毒生命周期的示意图。当宿主细胞被HIV病毒感染后，病毒RNA基因组 通过病毒编码的逆转录酶被逆转录成cDNAdcDNA随后被整合到宿主染色体DNA中，形成前病 毒DNA。额外的HIV病毒RNA基因组从前病毒DNA上被转录并转运至细胞质用于组装病毒颗 粒。成熟的HIV病毒从被感染的细胞中出芽而成为无细胞的病毒颗粒。
[0012] 图2示出了用于测量干血斑中无细胞病毒颗粒的设置的示例性实施方案的示意 图。首先，将在Whatman滤纸上具有DBS的HIV患者样品放置在离屯、柱中并与固定/洗脱或提 取缓冲液一起溫育。当从DBS中提取出病毒颗粒后，通过，例如，离屯、或真空使含有病毒的缓 冲液通过离屯、柱中的过滤器。然后，将收集到的流出缓冲液放置在CAP/CTM上用于进一步的 样品制备和祀标扩增W及检测。
[0013] 图3示出了用于测量固定在Whatman 903滤纸上的DBS中无细胞病毒颗粒的方法的 示例性实施方案的详细示意图。一经再水化和固定，大多数血细胞保持在滤纸表面并且与 细胞结合的HIV DNA和RNA被包含在被感染的细胞内，而无细胞的病毒颗粒则扩散进入洗脱 缓冲液中。一些血细胞(包括被HIV感染的细胞和细胞碎片)也可能从903滤纸上脱落。当进 行离屯、时，离屯、柱过滤器阻止细胞或细胞碎片而非被洗脱的无细胞病毒通过，并从流出溶 液中收集无细胞的HIV病毒。
[0014] 图4示出了相对于血浆病毒载量，干血斑SPEX和PBS洗脱的分析性能。
[001引图5示出了在使用PBS洗脱的条件下，DBS与血浆病毒载量之间的临床相关性。应用 了0.6 log的校正系数。
[0016]图6示出了将DBS病毒载量方法与作为参照方法的血浆病毒载量进行比较的偏差 图。
[0017]图7示出了 DB巧血浆的病毒载量ii量结果的相关性和一致性。
[001引发明详述 尽管可W获得可W减少与细胞结合的DNA对DBS病毒载量测量结果的影响的产品，但是 本文所述的方法可W同时减少与细胞结合的RNA和与细胞结合的DNA。所述方法易于操作并 且不需要复杂的仪器和生化处理。重要的是，该方法不会改变现有的DBS样品采集方法，或 改变现有的下游方案，例如，RMD CAP/CTM HIV-1 DFSP产物。
[0019] 使用仅能从再水化的DBS中洗脱出无细胞的病毒颗粒(例如，无细胞的HIV病毒颗 粒)而不会破坏DBS上的细胞或细胞碎片的溶液或提取缓冲液来对DBS(例如，HIV DBS)进行 再水化可