抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体外制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽药领域，尤其是一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体 外制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性喉气管炎（ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV)引起的鸡的一种急 性接触性呼吸道传染病。鸡传染性喉气管炎按症状表现可分为喉气管炎型和眼型，维鸡发 病多表现为眼型。该病发病率接近100%，死亡率50%~70%，蛋鸡产蛋量明显下降。给养 禽业造成了巨大的损失，是集约化养鸡场的重要疫病之一。
[0003] 鸡传染性喉气管炎主要在秋冬季节和早春极易发生，多发于成年鸡，病因极其复 杂。病鸡主要通过呼吸道分泌物排出病毒，经空气传播；被病毒污染的蛋、饲料、饮水、用具 等也会传染。本病除经水平传播外，还可经卵垂直传播，鸡场一旦发生本病，很容易造成连 年发生。目前尚无治疗本病的的特效药，发病鸡群主要W投服抗菌药物为主，但是该方法不 能起到预防作用。通过药物提高机体抵抗力或调节免疫力也是一种预防鸡传染性喉气管炎 的有效方法，在此过程中转移因子可起到非常重要的作用。
[0004] 转移因子灯ransfer化Ctor, T巧是T淋己细胞释放的一种能够转移致敏信息的 可透析小分子物质-多肤核巧酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体 正常的淋己细胞，从而增强受体的免疫功能。可W抵抗真菌、病毒等非细菌性感染，也可W 是否白介素与干扰素作用于免疫应答过程。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无 毒副作用，是一种新型而又安全的免疫制剂。此外，转移因子无种属特异性，动物来源的转 移因子可用于人体。
[0005] 目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等，反复冻融并经半透膜透析 得到，工艺复杂，无特异性，回收率低。本发明通过体外制备抗鸡传染性喉气管炎病毒特异 性转移因子特异性强、产出率高，对转移因子的大规模工厂化生产W及大范围应用具有很 好的促进作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备W及针对疾病没有特异性，治疗效 果不稳定等缺点，提供一种体外免疫方法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗 鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备方法。
[0007] 本发明抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，按照W下步骤 进行：
[0008] (1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋己细胞单层。无菌静 脉采取动物全血20-30ml，加 0. 8 %肝素溶液0. 3ml抗凝，静置30-60min，用带胶球吸管吸取 红细胞层W上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离 必管内，用PBS (pH为7. 2)液反复洗涂2-3次，离必速度800-1200转/分，然后用含30%辕 牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100mL细胞培养瓶中，塞 紧瓶塞，置37C细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋己细胞单层；
[0009] (2)对所制备的淋己细胞单层进行传代培养；显微镜下观察（1)中所制备的淋己 细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
[0010] (3)抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备：当传代的淋己细胞长成单 层后，用植物血凝素（终浓度为lOOmg/L)和鸡传染性喉气管炎病毒（终浓度为1000-1500 血凝单位/ml)诱导培养，离必培养2-3天后，8000转/分、20-30min离必细胞培养液，取上 清液，将其置于4C下磁力揽拌透析18-24h，超滤除菌，即获得体外制备抗鸡传染性喉气管 炎病毒特异性转移因子。
[0011] 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，刺激鸡脾细胞和 鸡血淋己细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为50-100mg/L。
[0012] 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，；制备淋己细胞 单层W及细胞培养均在无菌状态下进行。
[0013] 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，离必时均需在 4 C进行。
[0014] 一种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，超滤除菌所需滤 膜为0. 22 Um滤膜。
[0015] 本发明的优点及有益效果是：
[0016] (1)本发明所需鸡脾脏或外周血等原料较少，用植物血凝素和鸡传染性喉气管炎 病毒诱导培养诱导淋己细胞单层即可体外生产出大量抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转 移因子的混合体。
[0017] (2)本发明的方法制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子无需进一步的 提纯，直接将混合体用于禽类。
[0018] (3)本发明所得到的特异性转移因子即可起到抗鸡传染性喉气管炎病毒及抗菌的 作用，同时又可W提高禽类的免疫力。
[0019] (4)本发明具有特异性强、成本低、产出率高、效果好等优点，是一种较为理想的鸡 传染性喉气管炎病毒转移因子制备方法。
【具体实施方式】
[0020] 本发明通过W下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是 限定性的，不能W下述实施例来限定本发明的保护范围。
[00川 实施例1
[0022] -种抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其制备方法的步 骤如下：
[0023] (1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋己细胞单层。无菌静 脉采取动物全血30ml，加0. 8 %肝素溶液0. 3ml抗凝，静置60min，用带胶球吸管吸取红细胞 层W上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离必管内， 用PBS (抑为7. 2)液反复洗涂3次，离必速度1200转/分，然后用含30%辕牛血清水解乳 蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100mL细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37°C 细胞培养箱中，经3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋己细胞单层；
[0024] 似对所制备的淋己细胞单层进行传代培养；显微镜下观察（1)中所制备的淋己 细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
[0025] (3)抗鸡传染性喉气管炎病毒特异性转移因子的制备：当传代的淋己细胞长成单 层后，用植物血凝素（终浓度为lOOmg/L)和鸡传染性喉气管炎病毒（终浓度为1250血凝 单位/ml)诱导培养，离必培养3天后，8000转/分、30min离必细胞培养液，取上清液，将其 置于4C下磁力揽拌透析2