多肽、融合酶及其制备方法和用图
【专利说明】多化、融合酶及其制备方法和用途 发明领域
[0001] 本发明属于生物学与酶工程工业领域，具体地，涉及与多肤融合的酶类、其编码核 酸，W及包含所述编码核酸的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及上述融合酶类的制备方 法及其用途。
[0002] 发明背景
[0003] 纤维素结合域（Cellulose binding domain, CBD)是存在于纤维类原料酶（如 纤维素酶）中的相对分子质量在0. 4X 104~2. 0X 104Da不等的片段，可特异结合纤维素 基质，后者为纤维素酶的底物。CBD序列可W与纤维素酶融合，改善其对底物的结合能力 [1，2,3,4]。
[0004] 脂肪酶，也是一种重要的工业用酶，具有非常广泛的应用前景。为了更好地使其适 应工业化需求，研究者们对其热稳定性、产量和活性的改造投入了很多精力。
[000引然而，关于CBD序列对脂肪酶活性影响的研究，还鲜有报道。
【发明内容】
[0006] 第一方面，提供了多肤，其包含选自W下的序列或由选自W下的序列组成：
[0007] (a)如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，W及
[0008] 化）由（a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列。
[0009] 在具体的实施方案中，上述氨基酸序列为纤维素结合域序列。
[0010] 在优选的实施方案中，本申请的多肤由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成。在 本文中，由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的多肤被命名为CBOnew。
[0011] 在优选的实施方案中，本申请的多肤序列为由上述（a)所述的序列经过取代、缺 失或添加一个或几个，优选1个-10个，更优选2个-8个，更优选3个-5个氨基酸后得到 的序列。
[0012] 第二方面，提供了多核巧酸，其包含选自W下的序列或由选自W下的序列组成：
[0013] (a)核巧酸序列，其编码SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少 一个氨基酸取代、缺失或添加的序列；W及
[0014] 化）在严格条件下与a)中的核巧酸序列杂交的核巧酸序列。
[0015] 在一实施方案中，本申请的多核巧酸包含SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列。在优 选的实施方案中，上述多核巧酸由SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列组成。
[0016] 第Η方面，提供了融合蛋白，其包含第一方面所述的多肤部分W及酶部分。在一些 实施方案中，所述酶为水解酶，优选为脂肪酶。在更优选的实施方案中，所述脂肪酶为米黑 根毛霉烟lizomucor miehei)脂肪酶RML。在优选的实施方案中，所述多肤部分与酶部分优 选通过连接子连接。
[0017] 第四方面，提供了核酸分子，其编码上述融合蛋白。
[0018] 第五方面，提供了表达载体，其包含编码上述融合蛋白的核酸分子。
[0019] 在某些实施方案中，本发明的表达载体还包含调节多核巧酸表达的调控序列，其 中多核巧酸与调控序列可操作地连接。在优选的实施方案中，所述表达载体为祀T30a。
[0020] 第六方面，提供了包含本申请的融合蛋白、或核酸分子、或表达载体的宿主细胞。 在优选的实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌巧scherichia coli)BL21。
[0021] 第走方面，提供了制备本申请的融合蛋白的方法，其包括：
[0022] 1)将第四方面所述的核酸分子克隆在表达载体上，
[0023] 2)将表达载体转入合适的宿主细胞中，
[0024] 3)在合适的培养基中，培养所述宿主细胞，
[0025] 4)从所述宿主细胞或培养基中分离并纯化所述融合蛋白。
[0026] 第八方面，提供了由上述方法制备的融合酶。在一些实施方案中，所述融合酶为融 合脂肪酶。在优选的实施方案中，所述融合酶为融合了 cmr"的RMURML-crnTw)。
[0027] 第九方面，本申请提供了提高酶活性的方法，其包括将第一方面所述的多肤与酶 融合。在优选的实施方案中，将上述多肤与脂肪酶融合，提高了脂肪酶的催化活性。
[0028] 第十方面，提供了本申请的多肤，或多核巧酸在提高酶活性中的用途。在优选的实 施方案中，所述酶为脂肪酶。
[0029] 第十一方面，还提供了本申请的核酸分子，或表达载体、或宿主细胞在制备融合酶 中的用途。
[0030] 第十二方面，还提供了本申请的融合酶的用途，例如融合脂肪酶在乳制品工业、家 具清洁产品、油脂化学和医疗领域（治疗肥胖和动脉粥样硬化等）中的用途。
[0031] 本申请通过将一种纤维素结合域序列与酶融合，例如与脂肪酶融合，提高了酶的 活性。在一个实施方案中，与本申请的纤维素结合域序列融合的米黑根毛霉脂肪酶（RML) 的活性提高了数倍。在另外的实施方案中，与纤维素结合域序列融合的酶具有更为广泛的 适宜温度范围，但其他酶学性质如最适抑和金属离子依赖性等并不受影响。
[0032] 附图简要说明
[0033] 图1为显示RML和RML-C抓融合蛋白表达的凝胶电泳图。最左侧泳道为分子量标 志物，泳道"1"为加入诱导剂前菌体取样结果；泳道"2"- "5"分别为加入诱导剂后，表达 RML、RML-CBD1、RML-CB护ew 和 RML-CBD3 的菌体取样结果。
[0034] 图2显示了用于RML和RML-C抓融合蛋白定量的电泳图。泳道1-4分别为100、 200、500 和 ΙΟΟΟμ g/mL 的 BSA 溶液；泳道 5-8 分别为 RML，RML-CBDl，RML-CBDnew 和 RML-CBD3 纯化蛋白溶液；最右侧的泳道为分子量标志物。
[0035] 图3显示了 W pNPP为底物时，RML和RML-C抓融合蛋白的醋水解活力。
[0036] 图4显示了 W pNPP为底物时，RML和RMkCBD融合蛋白在不同温度下的相对酶活 力。
[0037] 图5显示了 W pNPP为底物时，RML和RMkCBD融合蛋白的热稳定性。
[003引 图6显示了 W pNPP为底物时，RML和RMkCBD融合蛋白在不同抑下的相对酶活 力。
[0039] 图7显示了金属离子对RML-CBD融合蛋白活性的影响。
[0040] 图8a显示了 CBOnew和CBD2的表达结果，其中泳道1为RMkCBDnew表达总菌体变 性液样品，泳道2为RML-CBD2表达总菌体变性液样品，泳道3为IPTG诱导之前的大肠杆菌 总菌体变性液样品，W及最右侧的泳道为分子量标志物；图8b显示了 CBD2的纯化结果，其 中泳道1为IPTG诱导后总菌体破碎液上清，泳道2为上清液与Qigen Ni柱赔育后的流出 液，泳道3为Ni柱洗涂液，泳道4为Ni柱洗脱液，W及最右侧的泳道为分子量标志物；图8c 显示了 CBD2和CBOnew对RML比酶活的影响。
【具体实施方式】
[0041] 《化W及副!合帝白
[004引一方面，本申请提供了包含纤维素结合域的多肤，其包含SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列，或SEQ ID NO: 1所示序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的变体。
[0043] 另一方面，本申请提供了融合蛋白，其包含上述多肤部分W及酶部分。
[0044] 在优选的实施方案中，本申请的多肤由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成。在 具体的实施方案中，由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的多肤为一种纤维素结合域序 列，在本文中被命名为cmr"。
[0045] 由此，本申请提供了一种新的纤维素结合域序列，其与酶融合后能够显著提高酶 的催化活性。
[0046] 在一些实施方案中，SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的变体与SEQ ID NO: 1具有 至少 80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%^上的同源性。在优选 的实施方案中，多肤变体与SEQ ID NO: 1所示序列具有99% W上的同源性。
[0047] 本文所述的"同源性"被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核巧酸序列 变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算 机程序在本领域内是公知的。
[0048] 在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列基础上，取代、缺失或添加 1-30个，优选为1-20个，更优选为1-10个氨基酸残基后获得的多肤变体仍然能够与酶融 合，促进酶的活性。在优选的实施方案中，上述多肤变体与SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列 相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在更优选的实施方 案中，上述多肤变体与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列相差约1、2、3、4或5个氨基酸的取 代、缺失或添加。
[0049] 在一些具体的实施方案中，CBD"e"序列的C端或N端区域还可W被截短或添加约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25 或更多个氨基酸。
[0050] 在优选的实施方案中，SEQ ID NO: 1变体的序列是在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列中包含一个或几个保守性氨基酸取代的序列，其中经取代后的序列具有与cmr"类似 的功能。
[0051] 被称为"保守氨基酸取代"的某些氨基酸取代能够在蛋白质中频繁出现，但不改变 该蛋白质的构象或功能，送是蛋白质化学中已建立的法则。
[0052] 本申请中的保守氨基酸取代包括但不限于用甘氨酸佑)、丙氨酸（A)、异亮氨酸 (I)、鄉氨酸（V)和亮氨酸（L)中的任一个取代送些脂肪族氨基酸的任何另外一个；用丝氨 酸（巧取代苏氨酸（T)，反之亦然；用天冬氨酸（D)取代谷氨酸巧)，反之亦然；用谷氨醜 胺（曲取代天冬醜胺（脚