培养基中，10°C下 倒置培养。15d左右统计菌落生长情况，若菌落直径越大或菌落颜色越深，则该待测菌株具 有较强的原油降解能力。如图1所示，通过培养，发现菌株YF28-U8)菌落颜色较深；菌株 YF24-3(3)菌落直径较大;菌株TGL-Y2菌落直径较小，颜色较浅。
[0021] 实施例2: 原油降解菌降解能力的验证： 1、降解菌液体摇瓶培养： 将实施例1步骤2中获得的菌株YF28-l(8)、YF24-3(3)和TGkY2菌液离屯、，弃掉上清后 用无菌生理盐水洗涂并调整菌液浓度至〇〇6〇〇=0.7,接种菌液到Wl%(v/v)原油为唯一碳源 的MM液体培养基中，20°C震荡培养7d。单菌生长情况通过OD600表征，同时用重量法对原油降 解率进行测定，W未接种菌的原油培养基作为阴性对照，每株菌设Ξ个平行。经培养7d后发 现，菌株YF28-1 (8)和YF24-3(3)的原油MM培养基摇瓶内培养液非常混浊，原油分散，油膜 少;而菌株TGL-Y2的培养液则相对较清澈，油膜较多。培养结果如图2所示。
[0022] 2、降解率测定： 使用重量法对步骤1中的菌株其降解率进行测定，菌株对原油降解率测定结果如表2 所示。
[0023] 表 2
重量法：往振荡7d的MM液体培养基中加入lOmL石油酸，晃匀萃取，并将培养液W 500化· mirfi离屯、lOmin，转至分液漏斗，振荡多次，静置分层后，收集上层液，用石油酸洗涂 后合并上层液，在烘箱中65Γ蒸干称重。计算降解率，计算公式如下：
3、通过GC-MS进行验证： 同步骤1中的方法，将培养7d的菌液及正己烧的洗涂液全部倒入60ml的分液漏斗，充分 震荡使其中剩余原油充分萃取到有机溶剂相中，静置分层后用无水化2S化脱水，用0.22μπι 耐有机溶剂滤膜过滤，将过滤后的溶液进行GC-MS分析。
[0024] 实验所用色谱柱为VARIAN(30 mX0.25 mmX0.25皿)石英毛细管柱;检测器溫度 为280°C ;升溫程序:60°C恒溫2min，W升溫速率为8°C/min升溫到280°C，然后再恒溫5min; 载气(化)流量为1血/min;进样口溫度为270°C;进样量为2化;分流比为1:1 (V/V)。
[00巧]从图3可W发现，相比阴性对照，菌株YF28-1 (8)、YF24-3( 3)对原油中的烧控组分 均有不同程度的降解，其中对直链的饱和烧控具有较强的生物降解作用，且无论是偶碳数 还是奇碳数饱和烧控都具有较强的降解能力；而TGkY2虽有一定的降解能力，但是降解效 果均不及菌株￥。28-1(8)、￥。24-3(3)，运与实施例1所得结果一致。
[0026]最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 w对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种原油降解菌的快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将分离纯化得到的待测原油降解菌接种到液体培养基中，制成菌悬液； 2) 待步骤1)得到的菌悬液生长到对数期后，使用无菌牙签沾取后接种于以原油为唯一 碳源的MM固体培养基中，在20~30 °C的条件下培养，培养期为15d，得到培养菌落； 3) 对步骤2)得到的培养菌落进行观察，以菌落直径或菌落颜色判断待测原油降解菌的 原油降解能力。2. 根据权利要求1所述的一种原油降解菌的快速筛选方法，其特征在于，所述步骤1) 中，待测原油降解菌的分离纯化方法为:将5g受原油污染的土样置于45mL浓度为0.85%的生 理盐水中震摇30min，取土壤悬液梯度稀释，涂布到216L固体培养基上，于20°C下倒置培养； 待长出肉眼可见的单菌落时分离纯化，挑取单菌落于216L液体培养基中摇培成菌悬液。3. 根据权利要求2所述的一种原油降解菌的快速筛选方法，其特征在于，所述216L固体 培养基的组成为：乙酸钠1. 〇g，胰蛋白胨10. 〇g，酵母提取物2.0g，柠檬酸钠0.5g，硝酸铵 〇.2g，营养肉汤培养基OXOID 0.5g，琼脂粉15g，ddH20 lL，pH调节至7.6;所述216L液体培养 基的组成为：乙酸钠1. 〇g，胰蛋白胨10. 〇g，酵母提取物2.0g，柠檬酸钠0.5g，硝酸铵0.2g，营 养肉汤培养基OXOID 0.5g，ddH20 lL，pH调节至7.6。4. 根据权利要求1-3任一所述的一种原油降解菌的快速筛选方法，其特征在于，所述步 骤2)中，MM固体培养基的组成为:氯化镁3.5g，硝酸铵1.0g，氯化钾0.35g，氯化钙0.05g，溴 化钾0.08g，氯化铁0.01g，含有硫酸锌0.01%、氯化锶2.4%的金属盐溶液lmL，含有磷酸氢二 钾10%、磷酸二氢钾10%的磷酸盐溶液10mL，琼脂糖15g，ddH 20定容至1L，pH调节至7.5，最后 加入体积百分比为2%的原油。
【专利摘要】本发明公开了一种原油降解菌的快速筛选方法，包括以下步骤：1）将分离纯化得到的待测原油降解菌接种到液体培养基中，制成菌悬液；2）待步骤1）得到的菌悬液生长到对数期后，使用无菌牙签沾取后接种于以原油为唯一碳源的MM固体培养基中，在20～30℃的条件下培养，培养期为15d，得到培养菌落；3）对步骤2）得到的培养菌落进行观察，以菌落直径或菌落颜色判断待测原油降解菌的原油降解能力。本发明的有益效果为：本发明提供的一种原油降解菌的快速筛选方法，可一次检测多个菌株是否具有较强的原油降解能力，同时得到多个菌株的降解结果，且操作简单，效率高，节省时间，具有很好的推广使用价值。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105671116
【申请号】
【发明人】常思静, 杨蕊琪, 章高森, 陈拓, 刘光琇, 张威
【申请人】中国科学院寒区旱区环境与工程研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年12月3日