一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种酶抑制剂或促进剂的筛选方法，具体设及一种筛选酪氨酸酶抑制 剂或促进剂的方法。
【背景技术】
[0002] 酪氨酸酶是一种含铜酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。具有独特的双重催 化功能，是黑色素代谢和儿茶酪胺的关键酶，并且是白齋风自身免疫的重要抗原。酪氨酸酶 能催化k酪氨酸和k多己氧化生成黑色素。酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，其异常 过量表达可导致人体的色素沉着性疾病，果蔬褐变。酪氨酸酶抑制剂可W治疗目前常见的 色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑、老年斑，也被用作食品保鲜剂。酪氨酸酶促进剂可W用于 治疗白齋风。酪氨酸酶也与昆虫蚁皮过程中的较化作用有关。鉴于酪氨酸酶的广泛应用， 国内外很多学者致力于寻找具有特异的、高效的酪氨酸酶抑制剂或促进剂的研究方法，及 其作用机理、动力学原理和如何应用。
[0003] 目前临床上使用的酪氨酸酶抑制剂都有比较大的毒副作用。曲酸和维生素 C虽然 对酪氨酸酶有较强的抑制作用，但它们相对较不稳定，保质期较短；果酸对人体皮肤有较大 的刺激作用，也不受人们的好评；动物胎盘提取液、芦苔提取液成本高而且成分较复杂且易 变质，也有一定的不足之处。白齋风目前还没有确定显著疗效的药物，所W酪氨酸酶的抑 制剂或促进剂在生物、农学、药学和医学等研究领域有着重要的意义。
[0004] 从天然药物中寻找有效、低毒、价廉的酪氨酸酶抑制剂或促进剂更是成为目前酪 氨酸酶研究的主要方向。传统的酪氨酸酶抑制剂或促进活性筛选方法都要求化合物从中药 中分离、提纯出来并且需要足够大的量，通过体内外多种实验方法评价药用样品的活性，但 是许多从中药中得到的天然化合物却难W满足运些条件。薄层色谱一生物自显影技术可W 弥补W上技术的不足。薄层色谱一生物自显影是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结 合的药物筛选方法，具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高W及可W实现对生物活 性的快速测定的特点。 阳0化]Sakulna Wangt hong等人采用的酪氨酸酶抑制剂筛选方法是W k酪氨酸为 底物。每块板W喷雾法使每平方厘米含20ul的100U-200U/ml的酪氨酸酶和200ul的 2X 10 3-3X 10 3mM的レ酪氨酸，反应lOmin后显示出效果。其曲酸的最低检测线为 0. 020ug(胖angthong S, Tonsiripakdee I, Monhaphol Τ, et al. Post TLC developing technique for tyrosinase inhibitor detection.Biomedical Chromatograp hy，2007, 21(1) :94-100)。其不足之处在于：反应灵敏度偏低，反应时间偏长。此外，其采用 喷雾法操作不易掌握。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种快速筛选复杂天然产物或者单体化合物 中酪氨酸酶抑制剂或促进剂的方法。该方法具有操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高 w及能够在复杂体系中对样品的生物活性进行快速测定的特点。
[0007] 本发明的技术方案为：采用薄层色谱一生物自显影技术建立酪氨酸酶抑制剂或促 进剂的活性筛选方法，该方法能够高通量地筛选不同实验室的不同样品的抑制或促进酪氨 酸酶的活性。该方法W色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；该方法W薄层 板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的范围比紫外分光光度法更为广 泛。
[0008] 本发明的酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术是一种将薄层色谱分离和生物活 性测定相结合的药物筛选方法，基于酪氨酸酶和底物通过酶促反应会产生灰黑色的反应产 物一-黑色素（melanin)，抑制或促进酪氨酸酶活性的物质正是通过抑制或促进该反应的 发生，从而在薄层板上表现为灰黑色背景下的白色或深黑色斑点。
[0009] 具体而言，本发明提供了一种酪氨酸酶抑制剂或促进剂的筛选方法，所述方法包 括如下步骤：
[0010] (1)将供试品溶解于有机溶剂中，然后将供试品溶液点样于薄层板上，挥干溶剂， 备用；
[0011] (2)将步骤（1)得到的薄层板浸溃于酪氨酸酶溶液中，挥干溶剂后再浸溃于1~ 20mM/L的左旋多己化-D0PA)憐酸缓冲盐溶液中，取出薄层板后在20°C~40°C条件下进行 酶促反应；
[0012] (3)根据酶促反应后薄层板上的斑点颜色筛选供试品。
[0013] 在一优选例中，所述步骤（1)中还包括将点样于薄层板上的供试品在展开剂中展 开的步骤。
[0014] 在另一优选例中，所述展开剂选自石油酸、乙酸乙醋、二氯甲烧、丙酬、甲醇、乙醇、 乙酸、氨水和醋酸锭中的一种或一种W上。
[0015] 在另一优选例中，所述供试品溶液的浓度为0.0 Olmg/ml~200mg/ml，所述供试品 溶液的点样量为1~20 μ L。
[0016] 在另一优选例中，所述薄层板为硅胶板。
[0017] 在另一优选例中，所述酪氨酸酶溶液可由如下方法制得：
[0018] 将酪氨酸酶直接溶于抑值为6. 0~8. 0的20mmol/L的憐酸盐缓冲液，配制成酪 氨酸酶浓度为50~300U/mL的酪氨酸酶溶液。
[0019] 在另一优选例中，所述酶促反应的时间为5~40分钟。
[0020] 在另一优选例中，所述步骤（3)包括：酶促反应后，若在所述薄层板的灰黑色背景 下出现白色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶抑制剂；若在所述薄层板的灰黑色背景下出现 深黑色斑点，则所述供试品为酪氨酸酶促进剂。
[0021] 相对于现有技术，本发明的方法具有如下优点：
[0022] (1)操作简单，实验耗费低，不需要复杂的仪器和设备；
[0023] (2) W色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；
[0024] 做W薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的种类比紫外 分光光度法更为广泛；
[00巧](4) W反应自身为底色，实验步骤简单，误差因素少；
[00%] (5)薄层色谱具有分离功能，对于混合物或者植物提取物，能够先对其进行分离后 再检测。
[0027] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得W详尽描述。通过下文W及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【附图说明】
[0028] 图1为实施例1中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对曲酸的活性检测结 果图。
[0029] 图2为实施例2中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对不同浓度曲酸活性 检测的结果图（1为效果图，2为扫描结果图，3数据图）。
[0030] 图3为实施例3中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对维生素 C的活性检 测结果图（1为曲酸样品，2为维生素 C样品）。
[0031] 图4为实施例4中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对木犀草素的活性检 测结果图（1为曲酸样品，2为木犀草素样品）。
[0032] 图5为实施例5中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对白巧等的活性检测 结果图（1为曲酸样品，2为白巧等样品）。
[0033] 图6为实施例6中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对红景天乙酸乙醋部 分提取物的筛选结果图。
[0034] 图7为实施例7中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对曲酸、白巧等、维生 素 C的活性检测的不同时间及不同底物的结果图。
[0035] 图8为实施例8中利用酪氨酸酶一薄层色谱生物自显影技术对曲酸的活性检测的 不同时间及不同底物的扫描数据结果图。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按 重量计。
[0037] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0038] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可W任意组合。本专利申请说明书 所掲示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所掲示的各个特征，可W任何可提 供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所掲示的特征仅为均等或 相似特征的一般性例子。 阳〇例实施例1
[0040] 1. 1药物与试剂
[0041] 曲酸化3125-5G，L0T#BCBG6172V，购自 sigma),酪氨酸酶灯3824-50KU， L0T#SLBG4386V，购自 sigma), kD0PA(V90425-100G，L0T#WXBB1676V，购自 sigma),憐酸二 氨钟（批号F20100202,购自国药集团化学试剂有限公司），憐酸氨二钟（批号F20100118