用于插入核酸的载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于在细胞内的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法、W及用 于该目的的载体、试剂盒、和通过该方法获得的细胞。而且，本发明还设及含有包含所期望 的核酸的细胞的生物、及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 作为包含多个由DNA结合结构域和DNA剪切结构域构成的核酸酶亚基（亚单位）的 多肤，已知有TALEN(TALE核酸酶（TALE Nuclease))或ZFN(锋指核酸酶（Zinc Finger Nuclease))等(专利文献1~4、非专利文献1)。运些人工核酸酶在DNA结合结构域的结合部 位因多个DNA剪切结构域接近形成多聚体而引起DNA的双链剪切。DNA结合结构域重复包含 多个DNA结合模块，各DNA结合模块识别DNA链中的特定碱基对。因此，通过适当设计DNA结合 模块，可W在特定的核巧酸序列中进行特异性剪切。作为在特定的核巧酸序列中进行特异 性剪切的其他核酸酶，已知有CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶(非专利文献2)、或使 CRISPR/Cas系统与化kl核酸酶融合得到的RNA诱导型化kl核酸酶(FokI-dCas9)(非专利文 献3)。通过利用在修复由运些核酸酶进行的剪切时产生的错误或重组，进行基因组DNA上的 基因的缺失、插入和突变导入等各种基因修饰(参照专利文献5~6、非专利文献4)。
[0003] 作为利用人工核酸酶在细胞中插入所期望的核酸的方法，已知有非专利文献5~8 中记载的方法。非专利文献5中记载着:利用TALEN通过同源重组插入外来DNA的方法。另外， 非专利文献6中记载着:利用ZFN通过同源重组插入外来DNA的方法。但是，利用同源重组的 载体无法简便地制作成长链。另外，根据细胞或生物种，有时同源重组效率低，因此运些方 法只能用于有限的细胞和生物种。为了获得稳定具有插入了所期望的核酸的细胞的改良生 物，向动物胚胎中导入目标核酸后使胚胎分化而获得成体是有效的，但在动物胚胎中同源 重组效率低，运些方法没有效率。作为向动物胚胎中导入外来性DNA的技术，已知有ssODN介 导的基因修饰，但在该技术中只能导入约数lObp左右的短DNA。
[0004] 非专利文献7和8中记载的方法是不利用同源重组、而利用人工核酸酶向细胞中插 入核酸的方法。非专利文献7公开了下述方法:利用ZFN和TALEN剪切细胞内的核酸和应该插 入的外来DNA，利用非同源末端结合(N肥J)的作用连接两者的剪切部位，从而插入外来DNA。 但是，在非专利文献7所记载的方法中，无法控制所插入的核酸的方向，所插入的核酸的连 接点也不正确。非专利文献8所记载的方法是使通过核酸酶的剪切由细胞内的核酸产生的 单链末端和由外来性DNA产生的单链末端相互退火后再进行连接，W能够控制方向和进行 正确的连接。但是，非专利文献8所记载的方法中，为了防止对插入后的DNA再次进行剪切， 必须使用异源二聚体型的ZFN和TALEN，而无法使用活性高的同源二聚体型人工核酸酶。另 夕h非专利文献8所记载的方法不用于向动物胚胎中插入所期望的核酸。而且，非专利文献8 所记载的方法中，使单链末端在错误位点退火的发生频率高，而获得接受了正确插入的细 胞的频率不高。需要说明的是，非专利文献5~8中没有记载使用CRISPR/Cas系统等的RNA诱 导型核酸酶或化kl-d化s9等的RNA诱导型化kl核酸酶的方法。
[0005] 现有技术文献 专利文献 专利文献1:国际公开第2011/072246号； 专利文献2:国际公开第2011/154393号； 专利文献3:国际公开第2011/159369号； 专利文献4:国际公开第2012/093833号； 专利文献5:日本特表2013-513389号公报； 专利文献6:日本特表2013-529083号公报； 非专利文献 非专利文献l:Nat Rev Genet. 2010 S邱；11(9): 636-46; 非专利文献2:Nat Protoc. 2013 Nov; 8(11): 2281-308; 非专利文献3:Nat Biotechnol. 2014 化η; 32(6): 569-76; 非专利文献4:Cell. 2011 化 1 22; 146(2): 318-31.; 非专利文献5:Nat Biotechnol. 2011 化 1 7; 29(8): 731-4; 非专利文献6:Nat Biotechnol. 2009 S邱；27(9): 851-7; 非专利文献7:Biotechnol Bioeng. 2013 Mar; 110(3): 871-80; 非专利文献8:Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-46。
【发明内容】
[0006] 发明所要解决的课题 因此，本发明的目的在于获得一种不需要制作长链载体等的繁杂步骤、且可W在各种 生物种细胞内的核酸的规定部位正确且简便地插入所期望的核酸的方法，该方法还可W插 入达到较长链的核酸，可W与同源二聚体型的包含DNA剪切结构域的核酸酶、RNA诱导型核 酸酶、或RNA诱导型化kl核酸酶组合使用。
[0007] 用于解决课题的手段 本发明人着眼于夹有W插入核酸为目的的规定部位的由第1核巧酸序列构成的区和由 第2核巧酸序列构成的区，设计了对由细胞内的核酸所含的运些区构成的部分进行特异性 剪切的核酸酶。另外，本发明人设计了在从5'末端到3'末端的方向依次包含由第1核巧酸序 列构成的区、W插入为目的的所期望的核酸和由第2核巧酸序列构成的区的载体。然后，本 发明人将所设计的载体导入细胞中，使上述核酸酶与细胞发生作用，使在细胞内的核酸中 的上述规定部位发生剪切。另外，还使核酸酶与载体发生作用，生成在从5 '末端到3 '末端的 方向依次包含由第1核巧酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核巧酸序列构成的区 的核酸片段。如此操作，在细胞内，上述细胞内的核酸中的第1核巧酸序列和上述载体中的 第1核巧酸序列通过微同源介导的结合(MMEJ)来连接，而上述细胞内的核酸中的第2核巧酸 序列和上述载体中的第2核巧酸序列通过MMEJ来连接。由此，所期望的核酸被正确插入到细 胞的核酸的规定部位。对达到数化W上的较长链的核酸可W进行插入。虽然所使用的核酸 酶对插入前的包含细胞内的核酸所含的由第1核巧酸序列构成的区和由第2核巧酸序列构 成的区的部分进行特异性剪切，但连接后的核酸因插入上述所期望的核酸而失去该部分中 的一部分。因此，不会受到细胞内存在的核酸酶的再次剪切，可稳定地保持，可高频率地插 入所期望的核酸。
[0008] 由于该方法是通过在多种细胞中起作用的微同源介导的末端结合进行连接，因此 对于即使同源重组效率低的发生阶段的细胞等也可W正确且高频率地插入所期望的核酸， 可适用的生物和细胞的种类范围广。另外，该方法可同时对用于导入核酸酶的载体和用于 插入核酸的载体的细胞进行插入，操作简便。而且，该方法通过由微同源介导的末端结合引 起的细胞内的核酸部分的变化，可防止对插入后的核酸进行再次剪切，因此还可W使用活 性高的同源二聚体型结构域作为核酸酶中所含的DNA剪切结构域，实验材料的选择范围广。
[0009] 目P，在第1方案中，本发明提供一种载体，所述载体用于通过核酸酶在细胞所含的 核酸中的规定部位插入所期望的核酸， 运里，上述细胞所含的核酸在从5'末端到3'末端的方向依次包含由第1核巧酸序列构 成的区、上述规定部位和由第2核巧酸序列构成的区， 上述核酸酶对上述细胞所含的包含上述由第1核巧酸序列构成的区和上述由第2核巧 酸序列构成的区的部分进行特异性剪切， 上述载体在从5'末端到3'末端的方向依次包含由第1核巧酸序列构成的区、上述所期 望的核酸和由第2核巧酸序列构成的区。
[0010] 目P，在第2方案中，本发明提供一种载体，所述载体用于通过包含第1 DNA结合结构 域和第2 DNA结合结构域的核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸， 运里，上述细胞所含的核酸在从5'末端到3'末端的方向依次包含由第1核巧酸序列构 成的区、上述规定部位和由第2核巧酸序列构成的区， 在上述细胞所含的核酸中，由第1核巧酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核巧酸 序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核巧酸序列构成的区和由通过第 2 DNA结合结构域识别的核巧酸序列构成的区之间， 运里，上述载体在从5'末端到3'末端的方向依次包含由第1核巧酸序列构成的区、上述 所期望的核酸和由第2核巧酸序列构成的区， 在上述载体中，由第1核巧酸序列构成的区和由第2核巧酸序列构成的区分别位于由通 过第1 DNA结合结构域识别的核巧酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核 巧酸序列构成的区之间， 上述载体通过上述核酸酶生成在从5'末端到3'末端的方向依次包含由第1核巧酸序列 构成的区、上述所期望的核酸和由第2核巧酸序列构成的区的核酸片段。
[0011] 另外，在第3方案中，本发明提供第1或第2方案所述的载体，其中，上述细胞所含的 核酸中的第1核巧酸序列和上述载体中的第1核巧酸序列通过微同源介导的结合(MMEJ)来 连接，而上述细胞所含的核酸中的第2核巧酸序列和上述载体中的第2核巧酸序列通过MMEJ 来连接，由此插入上述所期望的核酸。
[0012] 另外，在第4方案中，本发明提供第2方案所述的载体，其中，上述核酸酶为同源二 聚体型核酸酶，上述载体为环状载体。
[0013] 另外，在第5方案中，本发明提供第1方案所述的载体，其中，核酸酶为化s9核酸酶。
[0014] 另外，在第6方案中，本发明提供第2方案所述的载体，其中，核酸酶为TALEN。
[0015] 另外，在第7方案中，本发明提供试剂盒，其用于在细胞所含的核酸中的规定部位 插入所期望的核酸，该试剂盒包含第1方案~第6方案中任一项所述的载体和用于表达核酸 酶的载体。
[0016] 另外，在第8方案中，本发明提供在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核 酸的方法，该方法包括如下步骤：向细胞中导入第1方案~第6方案中任一项所述的载体和 用于表达核酸酶的载体。
[0017] 另外，在第9方案中，本发明提供通过第8方案所述的方法获得的细胞。
[0018] 另外，在第10方案中，本发明提供包含第9方案所述的细胞的生物。
[0019] 另外，在第11方案中，本发明提供包含所期望的核酸的生物的制备方法，该方法包 括如下步骤:使通过第8方案所述的方法获得的细胞分化。
[0020] 另外，在第12方案中，本发明提供通过第11方案所述的方法制备的生物。
[0021] 发明效果 使用本发明的载体时，不需要制作长链载体等的繁杂步骤，不依赖于细胞或生物种中 的同源重组效率，可W在广泛的各种生物种的细胞内的核酸的规定部位正确且简便地插入 所期望的核酸而不会引起移码，还可W插入达到数化W上的较长链的核酸。另外，使用本发 明载体的核酸的插入方法可W与具有高核酸酶活性的同源二聚体型的包含DNA剪切结构域 的核酸酶组合使用。或者，使用本发明的载体的核酸的插入方法还可W与CRISPR/Cas系统 等的RNA诱导型核酸酶组合使用。而且，使用本发明的载体时，可W正确地设计连接点，可W 在框内敲入功能结构域，因此在使用包含作为标记的基因的核酸时，通过检测该基因的表 达，可W简易地鉴定发生了目标插入的生物，可W简便且高频率地获得插入有所期望的核 酸的生物。另外，使用本发明载体的核酸的插入方法可用于同源重组效率低的动物胚胎等 的未分化细胞，因此通过使用本发明的载体在未分化细胞中插入所期望的核酸，使所得的 未分化细胞分化，可W简便地获得稳定保持