用于生物合成异戊二烯的方法
【专利说明】用于生物合成异戊二稀的方法
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年8月5日提交的美国申请系列号61/862,401的优先权，其公开通 过提述W其整体并入。
技术领域
[0003] 本发明设及使用一种或多种分离的酶例如脱水酶，单加氧酶，细胞色素 P450,酷 基-[a邱]脱氨酶，甲径戊酸二憐酸脱簇酶，酷基-[acp]脱簇硫醋酶，和甲径戊酸-3-激酶中 的一种或多种;或使用表达一种或多种运些酶的重组宿主细胞生物合成异戊二締的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 对于生产特殊弹性体，包括电机安装/配件，手术手套，橡皮筋，高尔夫球和鞋子， 异戊二締是一种重要的单体。苯乙締-异戊二締-苯乙締嵌段共聚物形成热烙压敏粘合剂配 制剂的关键组分，而反式-聚-异戊二締用于轮胎的制造（Whited等，Industrial Biotechnology,2010,6(3),152-163)〇
[0006] 橡胶商品的制造依赖于进口来自己西橡胶树的天然橡胶，或基于石油的合成橡胶 聚合物(怖ited等，2010,见上文）。
[0007] 考虑到对石油化工原料和树木采伐的依赖，生物技术提供了通过生物催化的替代 方法。生物催化是使用生物催化剂，例如酶，来进行有机化合物的生物化学转化。
[000引因而，针对此背景，很明显对于生产中间物，特别是异戊二締的可持续方法有需 要，其中所述方法是基于生物催化的。
[0009] 生物衍生原料和石油化工原料两者都是生物催化工艺的可行起始材料。
[0010] 在通过生物催化过程合成异戊二締中，向中等碳链长度的酶底物中引入乙締基基 团是一个关键的考虑因素。
[0011] 在原核生物例如枯草芽抱杆菌和真核生物例如银白杨(Populus a化a)中，存在引 起异戊二締合成的已知代谢途径(Whited等，2010,见上文）。
[0012] 可W通过通向前体二甲基乙締基-PP的两种途径合成异戊二締，例如甲径戊酸和 非甲径戊酸途径化uzuyama,Biosci .Biotechnol .Biochem. ,2002,66(8), 1619-1627)。所述 甲径戊酸途径包含一种脱簇酶，甲径戊酸二憐酸脱簇酶(在下文中为MDD)，其将第一个乙締 基基团引入通向异戊二締的前体中。第二个乙締基基团由异戊二締合酶(在下文中为ISPS) 在异戊二締合成的最终步骤中引入。
[0013] 所述甲径戊酸途径（图1)已经在使用大肠杆菌作为宿主的异戊二締生物催化生产 中采用。工程化为具有甲径戊酸途径的大肠杆菌需要Ξ摩尔乙酷-CoA，S摩尔ATP和两摩尔 NAD(P)H来生产一摩尔异戊二締。考虑到甲径戊酸途径的22.5% (w/w)的理论最大产出，已 经W2g/(L . h)的体积计生产率从葡萄糖W和ll%(w/w)的产率W生物催化生产异戊二締 (Whited等，2010,见上文）。特别地，甲径戊酸到5-二憐酸甲径戊酸的憐酸活化在代谢上是 能量密集的，每摩尔异戊二締合成需要两摩尔ATP(图1)。因此，减少ATP消耗可W改进该途 径的效率。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明人已经确定可构建生物化学途径来从(R)-甲径戊酸，3-甲基-2-氧代戊酸， 4-甲基-2-氧代戊酸或异下酷-CoA，通过引入两个乙締基基团而不需要末端醇憐酸化来合 成异戊二締。运些途径依赖于脱水酶，单加氧酶，细胞色素 P450，或脱氨酶来引入第一个乙 締基基团；和Μ孤，甲径戊酸-3-激酶，酷基-[acp]脱簇硫醋酶(例如，化rM TE)或芳精醇脱水 酶来将第二个乙締基基团引入导致异戊二締合成的前体。本文所述的方法可W包括引入第 一个乙締基基团，引入第二个乙締基基团，或引入第一和第二乙締基基团两者。
[0016] 在本发明之前，不知道能够引入两个乙締基基团，而不需要末端醇憐酸化的酶可 W用于生成非憐酸化的中间物用于异戊二締合成。因此，本发明提供能够将中屯、前体甲径 戊酸，3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸或异下酷-CoA转化为异戊二締的酶。
[0017] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1下的2-径基酷基-CoA脱水酶，例如 化地C的基因产物(SEQ ID N0s:3和4)及其引发剂化dI(SEQ ID N0:2)，或HgdAB的基因产物 (沈Q ID N0s:6和7)及其引发剂册gC(SEQ ID N0:5)形成3-甲基-戊-2-締酷-CoA或4-甲基- 戊-2-締酷-CoA。在一些实施方案中，所述2-径基酷基-CoA脱水酶是酶工程的产物。从厌氧 细菌分离的2-径基酷基-CoA脱水酶拥有氨基酸降解途径中采用的常见催化机制。例如，来 自艰难梭菌（Clostridium difficile)的化地C/化dl的基因产物催化(10-2-?基异己酷- 0〇八转化为异己酷-(：〇4(13〇。曰9'6]1〇71-(：〇4)。类似的，化(^13/肋旨(：的基因产物催化2-径基- 戊二酷-〔〇4(2-117化〇巧旨1111日巧1-〔〇4)转化为戊締二酷-〔〇4(旨1111日(3〇]171-〔〇4)化;[1]1等， FEMS Microbiol. Reviews，2004，28，455-468)。见图2-5。
[0018] 在一些实施方案中，将第一个乙締基基团引入3-甲基-戊-2-締酷-CoA中，衍生于 中屯、代谢物3-甲基-2-氧代戊酸，其可W在一个或多个步骤中酶促转化为3-甲基-3-径基 戊-4-締酸或3-甲基-3-横酷-戊-4-締酷-ACP(例如，如图2中所示）。已证明来自卡那链霉菌 (5化691:〇1117。68 1^日]1日1117。61:;[。113)的1:。30的基因产物（56010^:14)对于直链和支链巧酷 基-ACP底物具有脱氨酶活性(Mo等，JACS，2011，133，976-985)。
[0019]在一些实施方案中，引入第一个乙締基基团，形成4-甲基-戊-2-締酷-ACP，衍生于 中屯、代谢物4-甲基-2-氧代戊酸或异下締-CoA，其可W在一个或多个步骤中酶促转化为4- 甲基-3-径基戊-4-締酸，4-甲基-3-横酷-戊-4-締酷-ACP，或3-甲基-3-下締-2-醇(例如，见 图3,图6和图7)。已经证明来自卡那链霉菌的tcsD的基因产物(SEQ ID N0:14)对于4-甲基- 戊-2-締酷-ACP具有脱氨酶活性(Mo等，2011，见上文）。
[0020] 在一些实施方案中，将第一个乙締基基团引入3-甲基-3-径基-戊酸，其可W在一 个或多个步骤中酶促转化为酶促转化为3-甲基-3-径基戊-4-締酸(例如，见图4)。已经证明 由111(1口]"编码的单加氧酶(569 10^:15)将末端双键引入结合到仲醇（36(3〇]1(1曰巧曰1(3〇11〇1) 的締丙基基团（ScMfer等，Appl. Environ .Microbiol .，2012，78( 17)，6280-6284)。
[0021] 在一些实施方案中，将第一个乙締基基团引入4-甲基-3-?基戊酸，其可W在一个 或多个步骤中酶促转为4-甲基-3-径基戊-4-締酸(见，例如，图5)。
[0022] 在一些实施方案中，将第一个乙締基基团引入甲径戊酸，其可W在一个或多个步 骤中酶促转为3-径基-3-甲基-戊-4-締酸(见，例如，图8)。
[0023] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.119下的（R)-特异性締酷-CoA水合 酶例如地aJ(SEQ ID NO: 16，F址ui等，J.Bacteriol. ,1998,180(3) ,667-673)或MaoC(SEQ ID N0:17;Park and Lee,J.Bacteriol. ,2003,185(18),5291-5397)的基因产物，或归类 于，例如EC 4.2.1.7下的细菌（S)-特异性締酷-CoA水合酶，例如YsiB的基因产物(SEQ ID NO: 1)将3-?基官能团引入3-甲基-戊-2-締酷-CoA或4-甲基-戊-2-締酷-CoA。在一些实施 方案中，所述締酷-CoA水合酶是酶工程的产物。用于将3-径基官能团引入3-甲基下烧-2-締 酷-CoA(3-methy化uten-2-enoyl-CoA)的单个酶候选物先前已经在Galactomyces reessii 的无细胞提取物中鉴定，含有归类于EC 4.2.1.17下的締酷-CoA水合酶，其将3-甲基下烧- 2- 締酷-〔〇4(3-11161:1171131116]1-2-6]1〇71-〔〇4)转化为3-径基-3-甲基下酷-〔〇4化66等， Appl.Environ.Microbiol. ,1997,63(11) ,4191-4195)。细菌来源的同等締酷-CoA水合酶活 性还未鉴定。见图4和图5。
[0024] 在一些实施方案中，通过使用归类于，例如EC 2.3. 1 .-(EC 2.3. 1.41，EC 2.3.1.79,或EC 2.3.1.80)下的β-酬脂酷-ACP-合酶，例如AnlF的基因产物(SEQ ID NO: 18) 缩合异下酷-CoA和丙二酷-ACP形成4-甲基-3-氧代戊酷-ACP。已经证明anlF的基因产物缩 合异下酷-CoA和丙二酷-ACP化echner等，ACS Synth.Biol.，2013，2(7)，379-83)。
[00巧]在一些实施方案中，由甲径戊酸二憐酸脱簇酶化e化rgy等，J.Biol.化em. ,2010， 285(27) ,20654-20663)或甲径戊酸3-激酶(Vinokur等，Biochemis化y,2014,53(25) ,4161- 4168)将第二个乙締基基团引入中等链碳链締酸(a化enoate)，将3-甲基-3-?基戊-4-締酸 或4-甲基-3-径基戊-4-締酸转化为异戊二締(图2-5)。
[0026] 在一些实施方案中，由脱簇硫醋酶(CurM TE)将第二个乙締基基团引入中等链碳 链締酸，将3-甲基-3-横酷-戊-4-締酷-ACP或4-甲基-3-横酷-戊-4-締酷-ACP转化为异戊二 締（见图2,图3和图6;Ge虹et等，J.Biol.Chem. ,2011,286(16) ,14445-14454)
[0027] 在一些实施方案中，由归类于，例如EC 4.2.1.127下的芳精醇脱水酶(Bro化orb 等，J.Biol.化em. ,2010,285(40) ,30436-30442)或归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶(例如从 物种例如Aquincola te;rtia;rica;rbonis或Methylibium peholeiphilum分离的脱水酶； Schiifer等，2011，见上文）引入第二个乙締基基团（见图巧日图7)。
[0028] 在一个方面，本文件的特征在于用于酶促合成异戊二締的方法。所述方法包括向 3- 甲基-戊-2-締酷-[a邱]，4-甲基-戊-2-締酷-[a邱]，3-甲基-3-径基-戊酸，4-甲基-3-径 基戊酸，或甲径戊酸酶促引入末端乙締基基团，并在一个或多个步骤中将所得的产物转化 为异戊二締。可^使用归类于6〔4.2.1.-下的脱水酶(例如，与56〇10^:22中的氨基酸序 列具有至少70%同源性的脱水酶），单加氧酶(例如，与SEQ ID NO: 15中的氨基酸序列具有 至少70%同源性的单加氧酶），细胞色素 P450还原酶，或酷基-[acp]脱氨酶(例如，与SEQ ID NO: 14中的氨基酸序列具有至少70%同源性的酷基-[acp]脱氨酶）引入第一个乙締基基团。 例如，可W使用酷基-[acp]脱氨酶将末端乙締基基团引入3-甲基-戊-2-締酷-[a邱]或4-甲 基-戊-2-締酷-[a邱]。例如，可W使用归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶将末端乙締基基团引 入甲径戊酸。例如，可W使用单加氧酶或细胞色素 P450还原酶将末端乙締基基团引入3-甲 基-3-径基-戊酸或4-甲基-3-径基戊酸。可W从3-甲基-2-氧代戊酸，4-甲基-2-氧代戊酸， 或异下酷-CoA酶促形成3-甲基-戊-2-締酷-[a邱]，4-甲基-戊-2-締酷-[a邱]，3-甲基-3-径 基-戊酸，4-甲基-3-径基戊酸或甲径戊酸。
[0029] 本文件的特征还在于用于酶促合成异戊二締的方法，包括向3-甲基-3-径基-戊- 4- 締酸，4-甲基-3-径基戊-4-締酸，4-甲基-3-横酷戊-4-締酷-[acp],或3-甲基-3-下締-2- 醇引入第二个末端乙締基基团w生产异戊二締。可w使用甲径戊酸二憐酸脱簇酶，甲径戊 酸3-激酶，酷基-[acp]脱簇硫醋酶，或芳精醇脱水酶引入所述第二个乙締基基团。所述甲径 戊酸二憐酸脱簇酶可W与SEQ ID N0s:8-ll中列出的任一氨基酸序列的甲径戊酸二憐酸脱 簇酶具有至少70%的同源性。所述甲径戊酸3-激酶可W与SEQ ID N0:12的氨基酸序列具有 至少70%的同源性。所述酷基-[a邱]脱簇硫醋酶可W与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至 少70%的同源性。芳精醇脱氨酶可W与与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有至少70%的同源 性。所述甲径戊酸二憐酸脱簇酶在比对SEQ ID NO: 11的残基74的位置可W具有组氨酸和/ 或在比对SEQ ID NO: 11的残基145的位置具有苯丙氨酸。所述甲径戊酸二憐酸脱簇酶可W 具有SEQ ID N0:11中列出的氨基酸序列，只是在位置74处用组氨酸取代精氨酸和/或在位 置145处用苯丙氨酸取代异亮氨酸。例如，所述甲径戊酸二憐酸脱簇酶可W将3-甲基-3-径 基戊-4-締酸或4-甲基-3-径基戊-4-締酸转化为异戊二締。例如，甲径戊酸3-激酶可W将3- 甲基-3-径基戊-4-締酸或4-甲基-3-径基戊-4-締酸转化为异戊二締。例如，酷基-[acp]脱 簇硫醋酶可W将3-甲基-3-横酷戊-4-締酷-[a邱]或4-甲基-3-横酷戊-4-締酷-[a邱]转化 为异戊二締。例如，芳精醇脱水酶可W将3-甲基-3-下締 -2-醇转化为异戊二締。
[0030]可W使用分离的酶进行本文所述的任意方法。
[0031 ]可W使用包含所述酶的细胞裂解物进行本文所述的任意方法。
[0032] 可W在重组宿主中进行本文所述的任意方法。例如，宿主可W是选自下组的原核 生物：埃希氏菌属（Escherichia)如大肠杆菌（Escherichia coli);来自梭菌属 (Clostridia)如杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或克氏梭菌（Clostridium kluyveri);来自棒状杆菌属 (Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum);来自贪铜菌属 (〔叫1'1日￥1(1113)如钩虫贪铜菌（〔叩1'1日￥1(1113]1日。日1：01')或耐金属贪铜菌（〔叫1'1日￥1(1113 metallidurans);来自假单胞菌属（Pseudomonas )如巧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)或恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida);来自芽抱杆菌属（Bacillus)如枯草 芽胞杆菌（Bacillus subtillis);或来自红球菌属（Rhodococcus)如马红球菌 (化odococcus equi)。所述宿主可W是选自下组的真核生物：曲霉菌属(Aspergillus)如黑 曲霉菌（Aspergillus niger);来自酵母菌（Saccharomyces)属如酿酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae);来自毕赤氏酵母属（Pichia)如己斯德毕赤酵母（Pichia pastoris);来自耶氏酵母属（Yarrowia)如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica);来自伊 萨酵母属（Issatchenkia)如东方伊萨酵母（Issathenkia orientalis);来自德己利氏酵母 属（Debaryomyces)如汉逊德己利氏酵母（Debaryomyces hanseni i );来自 Arxula属如 Arxula adenoinivorans ;或者来自克鲁维酵母菌属化luyveromyces)如乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)。
[0033] 所述宿主可W经历需要厌氧，微氧，或有氧培养的发酵策略。可W采用使用陶瓷中 空纤维膜的细胞保留策W达到并维持发酵期间的高细胞密度。
[0034] 进料至发酵的主要碳源可W衍生于生物或非生物原料。所述生物原料可W是W下 物质，或衍生于W下物质:单糖，二糖，半纤维素例如乙酷丙酸和慷醒，纤维素，木质纤维素， 木质素，甘油Ξ醋例如甘油和脂肪酸，农业废物或城市废物。所述非生物原料可W是W下物 质，或衍生于W下物质：天然气、合成气、0)2/此，甲醇，乙醇，非挥发性残留物(NVR)，来自环 己烧氧化过程的碱洗液，或来自化学或石油化学工业的其它废物流。
[0035] 本文件的特征还在于生产异戊二締的重组宿主。所述宿主包括至少一种编码W下 酶的外源性核酸：（i)2-径基酷基-CoA脱水酶或β-酬酷-ACP-合酶；（ii)酷基-ACP脱氨酶，单 加氧酶，细胞色素 P450,或归类于EC 4.2.1.-下的脱水酶和（iii)甲径戊酸二憐酸脱簇酶， 甲径戊酸3-激酶，酷基-[acp]脱簇硫醋酶，或芳精醇脱水酶，所述宿主生产异戊二締。所述 宿主可W包括至少一种编码W下酶的外源性核酸：（。2-径基酷基-CoA脱水酶，（ii)酷基- ACP脱氨酶，和（iii)甲径戊酸二憐酸脱簇酶，甲径戊酸3-激酶，酷基-[acp]脱簇硫醋酶，或 芳精醇脱水酶。所述宿主可W包括至少一种编码W下酶的外源性核酸：（。2-径基酷基-CoA 脱水酶，（ii)单加氧酶或细胞色素 P450,和（iii)甲径戊酸二憐酸脱簇酶，甲径戊酸